大小型层析柱的装填实践介绍(中文).ppt

A.Sprauer–5/06TOYOPEARL树脂填料的装填装填的一般原则

☆TOYOPEARL的装填压力最好在0.5-5bar的范围内
☆装填流速至少比实际操作流速高50%
☆不要使用会产生剪切力的装置（如：磁力搅拌器、齿轮泵）-这些装置会磨碎树脂填料并产生小颗粒
☆TOYOPEARL是一种刚性强的树脂填料，装填时务必区别于一般的软式琼脂糖凝胶基本步骤装柱前务必进行小颗粒去除的操作!
小颗粒的存在会阻塞筛板或烧结板，并最终会导致整个柱子的压降增大
小颗粒的去除采取悬浮静置移注法
重复这一步骤不少于3次TOYOPEARL粒径

CoarseC级规格:100µm
MediumM级规格:65µm
FineF级规格:45µm
SuperfineS级规格:35µm在去除小颗粒时的最后一次步骤中可加入装填缓冲液进行填料的平衡

最好根据实际生产中所使用的缓冲液选取合适的装填缓冲溶液

一般来讲，分离纯化工艺中将使用到的最高离子强度的流动相是装填缓冲液的首选
这一操作可以将填料装得最为紧密，并且可以防止死体积的发生或胶体内沟槽的出现。TOYOPEARL-典型的装填缓冲溶液利用量筒测量静置胶体体积或使用水泵抽滤浆液至湿滤饼后计算装填所需要的填料体积
通过添加装填缓冲液调节浆液浓度:
流动式装填柱~40-70%(v/v)
自动装填柱20-60%(v/v)
最终装填好的柱床体积是要小于装填前胶体静置体积或抽干的湿滤饼的体积Toyopearl
HW-40,HW-50,HW-55
HW-65andHW-75F

Ether-650,Phenyl-650
Butyl-650,DEAE-650
Super-Q-650,CM-650
SP-650andallAffinity

QAE-550CandSP-550C
恒流速装填法

恒压装填法

辅助的重力沉降装填法方法简介:
将柱底筛板用装填缓冲液润湿（赶走气泡）
任何时候，均需确保浆液在注入层析柱前进行过匀浆操作
匀浆液倒入后，立刻将分配器置于储槽内浆液表面
分配器与溶液浆液间不应有气泡存在
阶段性调整装填流速至目标流速，以产生一个实时的、没有太大振动的栓塞流
在最初的压实操作基础上，为进一步压实柱床，至少泵入5-10倍柱体积的装填缓冲液
调整分配器至胶体表面
重复后两个步骤，直至柱床被彻底压实。最后将分配器移至距离柱床2-5mm处（最后一次）。不要担心使用分配器的同时进行柱床的压实操作！模式柱尺寸
(I.D.xL)

2.2cmx60cm

9cmx30cm

25cmx30cm
Götec/Superformance20cmIDColumn装填RadialFlow-“SelfPacker”-presetcolumnvolume(Proxcys-CRIO)DynamicAxialCompression(Novasep,PeakBiotech,Technikrom,GEHealthcare)
不要使用没有进行正确柱效评价的层析柱!!!

SEC、RPC及HIC型层析柱的柱效与装填质量密切相关的。

只有IEC和AFC型层析柱，在没有高塔板数时也能正常工作。尽管如此，对称性因子还是相当重要的。使用5-10倍柱体积的低离子强度缓冲液进行柱子的平衡

使用低分子量、无保留的化合物进行柱效的测定（如：丙酮、盐）

进样体积为柱体积的0.25-1%

将测定而得的塔板数、不对称性因子与厂家提供的最小值相比较

如果未达到最小塔板数等期望值，必须重新进行柱子的装填！N=platespercolumn

Ve=elutionvolume[cmorml]

W1/2=widthofthepeakat
halfpeakheight[cmorml]

Symmetry:
Distanceb/a=peakwidth
at10%peakheight[cmorml]样品：丙酮理想的峰形(Gauß)与非理想的峰形前沿峰的处理
提高浆液浓度
降低装填压力
缩短静置时间(在柱中)

拖尾峰的处理
与前沿峰的处理方法相反

低柱效的处理
去除小颗粒
重新平衡胶体
改变样品/样品缓冲液
检查检测器/泵IIBeddepressioninthecenter装填好的柱子或已使用过的散装填料应保存在含有抑菌剂（如：20%的乙醇）的蒸馏水溶液中，并最好在4~25°C下存储。

储存后，如果需要重新使用层析柱，必须进行清洗操作。（盐析/盐沉淀的影响；微生物的生长；病毒的清除）工艺层析柱装填实例CustomertraininginEurope