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层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识一、实验目的和内容目的：1.掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2.熟悉凝胶层析的一般过程；3.了解凝胶介质的选择原则和应用领域。内容：1.SephadexG-50凝胶柱的装填；2.凝胶柱柱效测定；3．凝胶再生的方法。二、实验仪器和试剂1.实验仪器层析柱（1×40cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管2.实验材料和试剂SephadexG-50，0.02mol/LpH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据SephadexG-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02mol/LPBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次加入3－4mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1mL/min流速洗脱，记录tr(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）柱效计算公式：N=5.54•［θr/(W1/2)］2其中，θr为平均洗脱时间，W1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。[SephadexG-100每米理论塔板数为3000～6000]四、注意事项1.各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2.装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。3.始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。4.所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。五、演示（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法1.在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。2.接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。3.将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。4.按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。5.把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0”，同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在"0"位。6.上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。7.测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。记录仪光吸收A读数当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%刻度)位置时即为0.25A。数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:A量程选定在