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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN102478563102478563B(45)授权公告日2014.08.13(21)申请号201010559024.2卷周佳等.《气相色谱法用于不同育种方式抗(22)申请日2010.11.25虫水稻后代的代谢轮廓分析》.《第十七届全国色(73)专利权人中国科学院大连化学物理研究所谱学术报告会论文集》.2009,地址116023辽宁省大连市中山路457号YuweiChang等.《Metabolicprofiling(72)发明人许国旺常玉玮赵春霞路鑫basedonLC/MStoevaluateunintended周佳赵燕妮effectsoftransgenicricewithcry1Acand(74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限sckgenes》.《PlantMolBiol》.2012,第78卷公司21002审查员瓮龙明代理人马驰(51)Int.Cl.G01N30/88(2006.01)(56)对比文件US2005/0273275A1,2005.12.08,US2007/0083337A1,2007.04.12,JiaZhou等.《MetabolicprofilingoftransgenicricewithcryIAcandsckgenes:AnevaluationofunintendedeffectsatmetaboliclevelbyusingGC-FIDandGC-MS》.《JournalofChromatographyB》.2009,第877权权利要求书1页利要求书1页说明书6页说明书6页附图2页附图2页(54)发明名称一种用于研究转基因和非转基因水稻代谢差异的方法(57)摘要本发明公开了一种水稻代谢轮廓分析及代谢差异研究的方法,采用液相色谱-质谱联用技术对水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱,然后用多变量统计方法研究转基因水稻和非转基因水稻的代谢轮廓数据的整体差异,并发现对代谢表型差异有重要贡献的化合物,为转基因水稻的非预期效应和安全性评价提供依据。本发明的分析方法简单,快速,重复性好,适合于实际样品的批量分析。CN102478563BCN102478563BCN102478563B权利要求书1/1页1.一种用于研究转基因和非转基因水稻代谢差异的方法,其特征在于:采用液相色谱-质谱联用技术对水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱;然后用多变量统计方法研究转基因水稻和非转基因水稻的代谢轮廓数据的整体差异,发现对代谢表型差异有重要贡献的化合物,为转基因水稻的非预期效应和安全性评价提供依据;代谢轮廓谱获取的具体步骤为,1)取转基因水稻种子样本和非转基因水稻种子样本,分别研磨成粉末并过筛,获得二类粒径均一的水稻样本;2)水稻样品预处理:分别称取二类水稻种子样品于玻璃管中,向每支试管中加入含内标十九酰-溶血磷脂酰胆碱的提取溶剂甲醇/水,其中甲醇/水的体积比为3/2,涡旋,超声处理后离心,取上清液冻干重溶于甲醇/水的体积比=3/2的溶液中,涡旋,离心后,将上清液移至进样瓶中用于液相色谱质谱联用分析;3)对水稻样本依次进行液相色谱质谱联用分析;液相条件为:色谱柱为ZorbaxSB-Aq柱为1.8μm,3.0×100mm,流动相A为体积浓度0.1%甲酸溶液,B为乙腈;流速0.30mL/min,柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测;质谱条件为:电喷雾离子源ESI,采用正离子模式检测;使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂,干燥气温度350℃,干燥气流速为11L/min;离子源温度350℃,毛细管电压为4000V,溶剂化离子去簇电压175V,Centroid模式采集质谱数据;质量扫描范围m/z100~1000,获得被分析样本的总离子流图;最终得到水稻种子样本的总离子流图,其即为水稻种子代谢轮廓谱;将水稻种子样本中随机抽取一个样品或一个以上样品的混合物作为QC样,作为质谱检测过程中的质量控制标准;在对水稻样本依次进行液相色谱质谱联用分析过程中,先将QC样进样一次,然后每分析4-8个样本后,再将QC样进样一次,通过保证QC样总离子流图的重复性确保实验过程中液相色谱质谱联用仪无较大系统偏差,数据可靠;采用LC-MS数据处理软件对水稻种子样本的代谢轮廓谱进行峰提取,峰匹配后形成一个EXCEL数据矩阵;将数据矩阵中的变量进行缺失值处理,然后将在QC样本中RSD大于25%的变量删除,接下来利用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法对数据矩阵进行整体分析,对转基因水稻以及非转基因水稻的代谢指纹数据进行建模;根据模型中的变量重要性因子筛选对分类有重要贡献的10个或10个以上的检测离子,这些检测离子对应的代谢物可被认为是在转基因水稻及其对应的非转基因