用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CN103529139B(45)授权公告日(45)授权公告日2015.03.11(21)申请号201310429856.6周佳等.基于气相色谱-质谱联用技术的水(22)申请日2013.09.18稻代谢轮廓分析方法的建立.《色谱》.2012,第30卷(第10期),第1.1-1.2部分.(73)专利权人上海交通大学审查员王桂丽地址200240上海市闵行区东川路800号(72)发明人张大兵石建新胡朝阳(74)专利代理机构上海汉声知识产权代理有限公司31236代理人牛山陈少凌(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)(56)对比文件EP2592420A1,2013.05.15,全文.WO2006/112841A1,2006.10.26,全文.CN102478563A,2012.05.30,全文.权利要求书2页说明书13页附图1页(54)发明名称用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法(57)摘要本发明公开了一种用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法；本发明采用超高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术对自然品种水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱，进而获得各代谢物在不同自然品种水稻中的浓度变化范围，即为代谢物在自然品种水稻中的自然变异范围；在相同的测试条件下，对转基因水稻种子提取物进行分析，分析结果与自然变异范围进行比较：超过自然变异范围的，说明该代谢物的变化是非预期的；在自然变异范围内的，说明该转基因水稻和自然品种在种子代谢组水平实质上是等同的。本发明的分析方法具有高灵敏度、高通量的优点，由于考虑了代谢物的自然变异范围，此方法可以为深入研究转基因水稻的安全性提供根据。CN103529139BCN103529139B权利要求书1/2页1.一种用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A、采用超高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术对自然品种水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱,进而获得各种代谢物在不同自然品种水稻中的浓度变化范围，即为代谢物在自然品种水稻中的自然变异范围；B、在与步骤A相同的测试条件下，采用超高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术对转基因水稻种子提取物进行分析，分析结果与步骤A中的自然变异范围进行比较；代谢物浓度变化超过自然变异范围的，说明该代谢物的变化是非预期的，代谢物浓度变化在自然变异范围内的，说明该转基因水稻和自然品种在种子代谢组水平实质上是等同的。2.根据权利要求1所述的用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于，所述自然品种水稻种子包括所述转基因水稻种子的受体水稻种子；所述转基因水稻是以非转基因水稻为受体进行基因插入，经过自交并选择具有高赖氨酸蛋白特性的转基因水稻。3.根据权利要求2所述的用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于，所述自然品种水稻种子为中国水稻数据库中包含的核心骨干品种。4.根据权利要求1、2或3所述的用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于，所述对水稻种子提取物进行分析具体包括如下步骤：a、取水稻种子样品，分别在液氮中研磨成粉末；b、所述样品粉末中加入超纯水，震荡悬浮，悬浮液中加入提取液用以沉淀样品中的蛋白质，离心后，每种样品取三份上清液，氮气下吹干后冷冻抽干，形成三份待测样品，分别进行LC(+)，LC(-)，和GC-MS分析；c、将步骤b中LC(+)，LC(-)，和GC-MS分析获得的每个品种每种代谢物的浓度转化为标准分数z-score；将水稻种子代谢物浓度C取log2，对应的z-score＝(Log2C-mean)/SD，其中，log2C为所有品种水稻种子每种代谢物三个生物学重复浓度的均值,mean为所有自然品种中每种代谢物浓度均值，SD为自然品种中每种代谢物的标准偏差。5.根据权利要求4所述的用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于，所述对水稻种子提取物进行分析还包括：采用参照检测组分别进行LC(+)，LC(-)，和GC-MS分析，用于检测分析系统的稳定性；所述参照检测组选自所述步骤b中的三种待测样品混合形成的待测混合物、人的血浆样品、水中的一种或几种。6.根据权利要求4所述的用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于，所述步骤b中待测样品用于LC(+)分析时具体为：在待测样品中加入含有LC(+)稀释液后，采用超高效液相色谱-质谱联用法测定代谢物，并使用UHPLC-MS(+)模式进行分析。7.根据权利要求4所述的用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于，所述步骤b中待测样品用于LC(-)分析时具体为：在待测样品中加入LC(-)稀释液后，采用超高效液相色谱-质