可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其筛选方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102766633A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102766633A(43)申请公布日2012.11.07(21)申请号201210259171.7(22)申请日2012.07.25(71)申请人湖南大学地址410082湖南省长沙市河西岳麓山湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室(72)发明人王柯敏郭秋平刘小丹羊小海谭誉宇(74)专利代理机构湖南兆弘专利事务所43008代理人赵洪杨斌(51)Int.Cl.C12N15/115(2010.01)C12N15/10(2006.01)权利要求书权利要求书22页页说明书说明书66页页C12Q1/68(2006.01)序列表序列表22页页附图附图66页页(54)发明名称可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其筛选方法和应用(57)摘要本发明公开了一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，包括序列1～序列4中所示的DNA片段，还包括该核酸序列的一系列衍生物。本发明核酸适体的筛选方法包括以下步骤：首先合成随机单链DNA文库和引物，然后Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体，PCR扩增文库，制备DNA单链文库，然后经过重复筛选、阴性筛选、多轮筛选等步骤后，得到可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体。本发明的核酸适体可在识别人肝癌细胞株Bel-7404或者制备检测人肝癌细胞株Bel-7404的试剂盒中应用，具有特异性强、无免疫原性、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。CN102763ACN102766633A权利要求书1/2页1.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列1～序列4中的任意一条序列所示的DNA片段：序列1：5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGACGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；序列2：5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACGGGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；序列3：5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGTCATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；序列4：5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGTCATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’。2.根据权利要求1所述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。3.根据权利要求1或2所述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。4.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种：（1）与权利要求1或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上；（2）与权利要求1或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列进行杂交的序列；或者（3）权利要求1或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列转录的RNA序列。5.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体衍生物，其特征在于：所述衍生物是权利要求1或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。6.一种如权利要求1所述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：（1）合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：随机文库RS40：5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA(40N)TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA5’引物：5’-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’3’引物：5’-Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’；（2）Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体：培养Bel-7404细胞至基本铺满瓶底，去除培养基后用缓冲液洗涤，然后与随机序列在冰上孵育后，弃溶液；再将上述随机文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的Bel-7404细胞在冰上孵育；孵育完成后弃掉孵育瓶内的液体，并用缓冲液冲洗孵育瓶，然后用无菌水刮取孵育瓶内的Bel-7404细胞并置于沸水浴中加热，加热完成后再离心取上清，即为筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库；（3）PCR扩增文库：将步骤（2）中筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库进行常规P