生产菌种的培养与保存资料.ppt

第四章生产菌种的制备和保藏第一节生产菌种的制备过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
种子扩培的目的一、孢子的制备

放线菌孢子的制备：

营养要求：营养物质含量要低，特别是氮源
培养基：琼脂斜面培养基
培养温度：28~37℃
培养时间：5~14天
斜面含水量：低棒状链霉菌成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形，中间突起，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素，孢子为暗灰绿色，成熟后，孢子易于刮下棒状链霉菌斜面一般培养四到五天左右产生孢子，六到七天斜面孢子生长成熟，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素，孢子呈暗灰绿色霉菌孢子的制备：

营养要求：碳、氮含量要低，无机盐适量
培养基：天然农产品
培养温度：25~28℃
培养时间：4~14天
细菌种子的制备：

营养要求：营养丰富，氮源含量要高
培养基：牛肉膏、蛋白胨
培养温度：37℃
培养时间：1~2天（芽孢5~8天）二、摇瓶种子的制备

一级摇瓶→二级摇瓶→种子罐

三、种子罐种子的制备

一级种子罐→二级种子罐→发酵罐（三级发酵）

级数的确定：菌种的特性；发酵罐的体积谷氨酸：三级发酵发酵级数确定的依据四、种子制备过程举例斜面(AS1.299)一级种子（摇瓶）二级种子(种子罐)种子的质量要求：2、青霉素生产的种子制备斜面孢子大米孢子一级种子种子的质量要求第二节生产菌种的质量控制2.培养温度和湿度的影响
菌体生长温度范围宽些28~37℃，孢子形成温度窄27、28℃

3.培养时间
过短：孢子不成熟；低温保藏时、易死亡
过长：菌体代谢活力降低，产量低4.保藏时间
一般不超过一星期

5.接种量
在母斜面上形成单菌落，在子斜面上形成一层菌落
二、影响种子质量的因素及控制措施

1.影响因素：
①培养基
②培养条件
③培养时间
最适种龄：对数生长期后期

种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。④接种量
接入种子液的体积
接入后培养液体积

接种量范围：1~25%，但是一般认为大一点好
过大：菌体过度生长，营养物质及溶氧不能满足菌体需要，使菌体衰老、自溶
过小：生产期延长，以产生菌丝结团，产量降低2.种子质量的控制指标

菌体的形态
碳、氮、磷的代谢情况
菌株的生产能力
特殊酶活力3.种子异常分析

菌丝生长过慢：培养基质量不好；灭菌质量
不好；通入空气的温度过低

菌丝结团：接种量小；培养基粘度不当；搅
拌不好

菌丝粘壁：搅拌不好；装料系数少；泡沫多第三节生产菌种的保藏二、菌种保藏原理三、微生物菌种保藏的常用方法1、斜面低温保藏法
4℃保存，1~3月

2、液体石蜡封藏法
石蜡→灭菌→冷却→加入试管中
3、沙土管保藏法
1mol/L酸洗→1mol/L碱洗→

蒸馏水洗→烘干→过筛→

混合（3：2或1：1）→分装沙土管→
干接法：接孢子后，低温抽真空
湿接法：接孢子悬液后，低温抽真空
4、甘油低温保藏法

等体积混合→-20℃以下保存

通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有应用动物血清等的。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。等体积混合→分装冻干管

→冷冻至15℃以下→抽真空→封口→低温保存
冻干菌种的保藏与再生6、液氮超低温保藏法(一)冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。
(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤

1．待冷冻保藏菌种悬液的制备

(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，
(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。

2．控速冷冻
(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；
(2)将此金