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胃泌素释放肽前体双抗体夹心酶联免疫吸附法的建立及其应用
胃泌素释放肽（gastrin-releasingpeptide，GRP）是一种神经肽，其在体内的生理功能涉及多种生理过程，包括食欲、消化、炎症和神经递质的调控等。GRP的高表达与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关，因此，对GRP的检测和分析具有重要的临床诊断和治疗意义。本文旨在介绍一种GRP前体双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）的建立及其在临床中的应用。
1.方法
1.1实验材料和仪器
GRP和GRP前体抗原、GRP前体多克隆抗体、乙酰化荧光素（Ac-FLFNPETHL-amide）标记GRP前体、HRP标记的兔抗鼠IgG、TMB底物、2%BSA、0.05%Tween-20等均购自Sigma公司。ELISA板、自动洗板机、多功能酶标仪等实验仪器均自购。
1.2建立GRP前体双抗体夹心ELISA方法
（1）免疫吸附板涂层：将GRP前体抗原溶液（2ug/ml）加入96孔ELISA板孔中，孵育过夜于4℃，洗涤4次，每次用PBS-Tween20缓冲液洗涤。
（2）制备双抗体夹心：用0.05M的碳酸钠缓冲液pH9.6调制5ug/mL的吸附GRP前体多克隆抗体(Mab1)溶液，加入96孔ELISA板，孵育2小时于37℃，洗涤4次，每次用PBS-Tween20缓冲液洗涤。然后加入2%BSA（100ul/孔）孵育1小时于37℃，洗涤4次，每次用PBS-Tween20缓冲液洗涤。加入稀释1倍的样品、标准GRP前体或对照组29ul/孔，孵育4℃过夜。洗涤4次，每次用PBS-Tween20缓冲液洗涤。
（3）HRP标记兔抗鼠IgG对双抗体进行检测：HRP标记的兔抗鼠IgG溶液（1:10000）加入96孔ELISA板孔中，孵育1小时于37℃，洗涤4次，每次用PBS-Tween20缓冲液洗涤。加入一种接触泡沫板（100ul/well）孵育30分钟于室温，加入100ulTMB底物，于室温下孵育30分钟，加入称量1MH3PO4（50uL/well）终止反应。读取OD450nm的吸光度值。
1.3构建标准曲线
制备grp前体标准品溶液，通过对标准品溶液逐渐稀释，制备标准曲线。然后根据测定样品的吸光度，利用标准曲线计算出样品中GRP前体的浓度。
2.结果及分析
成功构建GRP前体双抗体夹心ELISA模型，并构建了标准曲线。通过对临床病例进行分析，发现GRP前体在多种恶性肿瘤中高表达，而在其他良性疾病中表达较低。该ELISA模型在测定GRP前体的临床有效性上具有高度的灵敏性和特异性。
3.讨论
目前，能够准确检测GRP前体的方法较少，缺乏高度特异性和灵敏性的检测方法，因此在临床肿瘤诊断和治疗中具有较大的应用潜力。本文提出的GRP前体双抗体夹心ELISA方法，具有较高的灵敏度和特异性，可以较好地满足临床对GRP前体的检测需求，为肿瘤诊断和治疗提供有效的手段。需要注意的是，由于GRP前体在其他良性疾病中也会有一定程度的表达，因此在测定GRP前体时需要结合其他临床指标和病史等综合分析。