人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103184187A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103184187103184187A(43)申请公布日2013.07.03(21)申请号201110448358.7(22)申请日2011.12.28(71)申请人连祺周地址362000福建省泉州市鲤城区东街250号(72)发明人连祺周(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书6页说明书6页(54)发明名称人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法(57)摘要本发明提供一种人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法，其包括步骤：A、基于患者的眼表组织，分离人结膜基质成纤维细胞和人结膜上皮细胞；B、在所述成纤维细胞和人结膜上皮细胞导入基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，诱导产生iPSCs；C、在所述iPSCs中加入IV型胶原、采用KSFM细胞培养基和SHEM细胞培养基轮流诱导的方法，对所述iPSCs向角膜上皮样细胞定向分化。本发明提供的分化方法快速、简便、高效，可大量获得角膜上皮干细胞。CN103184187ACN103847ACN103184187A权利要求书1/1页1.一种人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法，其特征在于，包括步骤：A、基于患者的眼表组织，分离人结膜基质成纤维细胞和人结膜上皮细胞；B、在所述成纤维细胞和人结膜上皮细胞导入基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，产生诱导性多能干细胞iPSCs；C、在所述iPSCs中加入IV型胶原、采用KSFM细胞培养基和SHEM细胞培养基轮流诱导的方法，对所述诱导性多能干细胞iPSCs向角膜上皮样细胞定向分化。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：采用眼表组织来源的人结膜基质成纤维细胞和人结膜上皮细胞进行诱导性多能干细胞系的建立；所述步骤B中，采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、畸胎瘤形成及基因芯片分析的方法进行诱导性多能干细胞系鉴定。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤C中，还进行角膜上皮样细胞表型鉴定。2CN103184187A说明书1/6页人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法技术领域[0001]本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法。背景技术[0002]角膜上皮干细胞(LimbalStemCells，LSCs)，即角膜缘干细胞，位于角膜缘上皮基底层，是角膜上皮的唯一细胞来源。角膜上皮干细胞能够进行自我更新，以维持这些干细胞的高度增殖能力。角膜上皮干细胞可以生成短暂扩充细胞，后者向中央角膜移动，最终进入终末分化，形成角膜上皮细胞。角膜上皮干细胞不仅可以分化、增生为上皮细胞，更重要的是角膜上皮干细胞像一道屏障，可以阻止结膜上皮细胞移行至角膜表面，对维持角膜上皮的动态稳定和角膜透明性发挥着极其重要的作用。[0003]单眼角膜上皮干细胞缺乏患者，可以采用自体健眼角膜缘组织移植，以及健眼干细胞体外扩增后的移植。对于双眼角膜上皮干细胞缺乏患者，可以采用异体角膜缘移植，但由于异体移植易发生排斥反应，临床效果并不理想。近年来，有研究采用自体口腔粘膜上皮细胞体外扩增后移植，但研究发现，体外培养3-4周的口腔粘膜上皮细胞并不能分化为角膜上皮细胞表型，也不表达眼表面上皮细胞特异性的转录因子PAX6，粘蛋白表达与正常角膜上皮细胞也存在较大差异。移植于眼表面的口腔粘膜上皮细胞在体内也不能分化为角膜上皮细胞表型。术后短期内角膜虽然维持较好的透明度，长期随访发现角膜易产生新生血管。由此可见，角膜上皮重建的理想的细胞来源仍然是自体角膜上皮干细胞，对于双眼干细胞缺乏患者的治疗，仍有待于寻找一种能够分化为正常角膜上皮细胞的“种子细胞”，这也是目前角膜上皮组织工程研究的重点。[0004]除了成体干细胞，多能干细胞(pluripotentStemCells)包括胚胎干细胞(EmbryonicStemCells，ESCs)和诱导性多能干细胞(InducedPluripotentStemCells，iPSCs))也被用于在体外诱导产生角膜上皮干细胞。Homma(人名)等人将鼠胚胎干细胞培养于IV型胶原上，成功诱导出上皮干细胞，并用于修复鼠角膜上皮损伤。Hiroki(人名)等将PAX6基因导入小鼠胚胎干细胞，成功诱导出具有角膜上皮细胞特征的上皮样细胞。最近有研究将人胚胎干细胞培养于IV型胶原上，并用人角膜缘成纤维细胞条件培养基共培养，成功诱导出上皮样细胞，但进一步分化产生的终末分化细胞不但具有角膜上皮表型，还具有皮肤表型。由于胚胎干细胞具有无限增殖潜能，使其成为治疗角膜上皮干细胞缺乏的一种很有潜力的种子细胞来