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酸性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件研究
摘要：
酸性植酸酶是一种重要的酸性水解酶，具有广泛的应用前景。本研究采用土壤样品为初筛材料，从中分离筛选出酸性植酸酶产生菌，并通过形态学、生理生化及16SrDNA序列分析进行鉴定。最终确定一株产酸性植酸酶的菌株，并在液体培养基下进行了发酵条件优化，包括培养基配方、温度、pH、培养时间等。结果表明，该菌株在50mL液体培养基中，添加麦芽糖5g/L、植酸酸钠2g/L、NaNO32g/L、KH2PO41.2g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L和FeSO4·7H2O0.01g/L，pH3.5，温度37℃，震荡速度150r/min的条件下发酵72h，酸性植酸酶活力最高可达0.886U/mL。
关键词：酸性植酸酶；筛选；鉴定；发酵条件
Abstract:
Phytaseisanimportantacidhydrolyticenzymewithawiderangeofapplications.Inthisstudy,soilsampleswereusedasinitialscreeningmaterialstoisolateandscreenforacidphytaseproducingbacteria,andidentificationwascarriedoutthroughmorphological,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsaswellas16SrDNAsequenceanalysis.Finally,onestrainofphytase-producingbacteriawasidentified,anditsfermentationconditionswereoptimizedinliquidmedium,includingmediumformulation,temperature,pH,culturetime,etc.Resultsshowedthatthestrainreachedthehighestacidphytaseactivityof0.886U/mLundertheconditionsof5g/Lmaltose,2g/Lsodiumphytate,2g/LNaNO3,1.2g/LKH2PO4,0.5g/LMgSO4·7H2Oand0.01g/LFeSO4·7H2O,pH3.5,temperature37℃,andshakingspeed150r/minafterfermentationfor72hin50mLliquidmedium.
Keywords:acidphytase;screening;identification;fermentationconditions
正文：
1.引言
酸性植酸酶是一种广泛存在于真核生物和细菌中的酸性水解酶，对于植物及其衍生产品中含有大量未被动物消化吸收的植酸盐，可将其水解成无机磷和酸性较小的低聚磷酸盐，在动物肠道内充分吸收利用，从而提高动物生长效率和减少环境污染。同时，酸性植酸酶还具有在制备果汁、葡萄酒和啤酒等食品工业中降低植酸盐含量的作用，并在草料发酵、减轻人体钙质流失等领域有着广泛的应用[1，2]。
由于酸性植酸酶技术应用领域广泛，因此许多研究致力于酸性植酸酶的筛选、分离、鉴定和发酵条件的优化研究。本研究通过采用土壤样品为初筛材料，筛选出酸性植酸酶产生菌，并通过形态学、生理生化和16SrDNA序列鉴定，最终得到一株酸性植酸酶产菌株，并优化其发酵条件，进一步提高酸性植酸酶活力。
2.材料与方法
2.1筛选酸性植酸酶产生菌
采用土壤样品为初筛材料，于30℃下在含有植酸酸钠（2g/L）、麦芽糖（5g/L）、NaNO3（2g/L）、KH2PO4（1.2g/L）、MgSO4·7H2O（0.5g/L）和FeSO4·7H2O（0.01g/L）的培养基中培养7d，筛选出酸性植酸酶产生菌。待菌落形成后，在液体培养基中进行发酵，并分析其酸性植酸酶活力。
2.2酸性植酸酶活力分析
利用钼酸盐分光光度法[3]测定酸性植酸酶活力。具体步骤为：取反应液7mL，加入5mL1%（w/v）酚酞-磷酸盐酸盐缓冲液（pH5.2），再加入0.1mL菌液和0.9mL植酸酸钠溶液，并放在37℃水浴中振荡培养30min。添加3mL2.5%（w/v）氢氧化钠溶液使反应停止，然后进行琼脂糖过滤。滤液pH调至8.5左右，加入0.5mL0.05%（v/v）工业甲醛，继续振荡反应10min。用2.5%硫酸溶液至反应终点（抵消反应液的颜色）时终止反应。最后，以660nm处读数为酵素活力值。
2.3染色体的DNA提取、PCR扩增和测序
用含有1%（w/v）TritonX-100的盐水对菌株进行洗涤。将菌体遗传物质提取，使用PCR扩