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第五章 诊断酶学一、概述一、酶的概念与特征(一)酶的组成、结构与功能 1.酶的本质和特征 ⑴酶的化学本质:绝大部分的酶是蛋白质,有些酶是核酸和酶蛋白组成的复合体,极少数酶是核酸。 ⑵酶除了具有蛋白质的理化性质、一般催化剂的共同性质外,还具有极高的催化效率、高度的特异性(specificity)及催化作用的可调节性等特点。 ⑶由酶所催化的反应称为酶促反应。 酶促反应过程中的几个概念: 酶活性(activity);底物(substrate); 产物(product); 激活剂(activator);抑制剂(inhibitor) ⑷核酶(ribozyme):具有催化作用的核糖核酸。2.酶的结构和功能 ⑴酶和一般蛋白质一样,具有一、二、三乃至四级结构。 单体酶(monomericenzyme) 寡聚酶(oligomericenzyme) 多酶体系(multienzyme) 多功能酶或串联酶(tandemenzyme) ⑵单纯酶(simpleenzyme):仅由氨基酸残基构成的酶。 结合酶(conjugatedenzyme):除含蛋白质外,还含有非蛋白部分(金属离子或小分子有机化合物),前者称为酶蛋白,后者称为辅因子。二、同工酶的概念与特征酶三、工具酶 一、酶活性测定2.间接法采用酶偶联反应是间接法测定酶活性的主要技术特点。 (1)最简单的酶偶联反应(单底物反应且只有一个工具酶)模式为: Ex:被测定酶C:被检测物质Ei:指示酶 Ex催化的反应称为始发反应,产生被检测物质产物C的反应称为指示反应。 (2)如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联,此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶,将二者连接起来,此反应称为辅助反应。模式为: 一般习惯将最后一个酶称指示酶Ei,其他外加的酶称为辅助酶(Ea)。 (3)偶联反应中存在几个时相: ①预孵育期:反应一开始只存在底物A,不存在指示酶的反应。 ②延滞期:加入底物启动反应,在启动后的一段短时间内,产物B开始出现并逐渐增加,但仍处于较低水平,指示酶反应速度也较低,不能代表测定酶的反应速率Vx。 ③稳态期:产物B增加到一定程度时,Ex和Ei催化的反应速率相同,达到了稳态期。此阶段特定波长处(如340nm)吸光度才会有明显的线性变化。 (4)指示酶的选择 ①Vx/(Km)x=Vi/(Km)i Vi:指示酶的用量Vx:测定酶的测定上限 (Km)x:分别是测定酶(Km)i:指示酶的米氏常数 ②米-曼氏方程 在酶偶联反应中,指示酶催化反应速率Vi的计算公式为: 式中Vx为测定酶的测定上限,(Km)i为指示酶的米氏常数,P为中间产物浓度。 (三)干扰因素 1.其他酶和物质的干扰 2.酶的污染 3.非酶反应 4.分析容器的污染 5.沉淀形成 酶2.酶活性浓度单位临床上测定的不是酶的绝对量而是浓度。酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示。 (1)表示方法目前在临床化学中,各国学者几乎都习惯用U/L来表示体液中酶催化浓度。1U/L=16.67nkatal/L。 (2)酶活性浓度单位的计算用连续监测法进行酶活性测定时,不需作标准管或标准曲线,根据摩尔吸光系数很容易进行酶活性浓度的计算。摩尔吸光系数(ε)的定义为:在特定条件下,一定波长的光,光径为1.00cm时,通过所含吸光物质的浓度为1.00mol/L时的吸光度。 如用连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化(A/min),以U/L表示酶活性浓度时,则可按下式进行计算: 式中:V—反应体系体积(ml)ε—摩尔吸光系数(cm2·mol-1) v—样品量(ml)L—比色杯光径(cm) △A—吸光度变化106—将mol换算成μmol 临床常用血清酶的测定方法与参考区间(37℃)2.系数K值的类型与计算 系数K值只能供用户通过计算式及求实测K值时参考,不能直接用于酶活性浓度的计算。 2.酶活性浓度测定的参考系统 IFCC于1998年决定建立包括下列要素的测定酶催化浓度的参考系统: ①参考测定方法,以现有的IFCC30℃的参考方法作为基础,制定了一套37℃的标准操作方法(SOPs); ②参考实验室网络,选择一组参考实验室(包括厂家实验室),为之提供必要的技术和仪器,使之在计量学高水平上按参考测定方法(SOPs)进行测定; ③参考物,参考实验室网络对现有的BCR参考物进行重新认证。 建立原级参考方法 制备原级参考物 建立参考实验室网络 二、酶质量测定三、同工酶检测一、血清酶 (一)血清酶的来源与去路 1.血清酶的来源 2.血清酶的去路 血清酶的半寿期是指酶失活至原来活性一半时所需时间(T1/2),一般以半寿期来代表酶从血中清除的快慢。 几种血清酶的半衰期与分子量(三)血清酶的临床应用 正常