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利用CRISPRCas9技术创制水稻落粒性基因qSH1突变体及突变特征分析
摘要：
水稻的落粒性在其产量稳定性中发挥着至关重要的作用，而基因qSH1是影响水稻落粒性的重要调控因素。本研究利用CRISPRCas9技术创制水稻落粒性基因qSH1突变体，并对其进行了突变特征分析。结果显示，突变体中的qSH1基因发生了切割，部分突变体中qSH1基因发生了插入或缺失的突变。突变体在不同生长阶段的农艺性状不同，其中部分突变体早期生长速度较快，生物量较大，而部分突变体生长速度较慢，生物量较小。同时，突变体的落粒性也出现了显著的变化。本研究为今后开展水稻落粒性基因研究提供了重要依据。
关键词：水稻；落粒性；qSH1基因；CRISPRCas9；突变特征分析
引言：
水稻是我国主要粮食作物之一，其产量稳定性对国家粮食生产安全具有至关重要的作用。而水稻的落粒性则是水稻产量稳定性的重要因素之一。qSH1基因是影响水稻落粒性的重要调控因素。许多学者通过建立转基因水稻或利用突变体技术等手段研究qSH1基因的功能，但这些方法存在一定的局限性。近年来，CRISPRCas9技术的广泛应用，在基因研究领域中展现出了重要的优势。本研究利用CRISPRCas9技术创制了水稻落粒性基因qSH1突变体，并对其进行了突变特征分析。
材料与方法：
实验对象：
本研究选用富硒龙稻（OryzasativaL.）为实验对象。
CRISPRCas9的构建：
设计两个gRNA，在qSH1的编码序列中选择靶点；gRNA序列分别为：gRNA1（5’-GGCGTCTGTGGGATCTCGGC-3’）和gRNA2（5’-CTCAAATCAAAATCTCACAG-3’）。
通过PCR扩增两个gRNA序列，然后ligation到pYLCRISPRCas9P35S-HYgplasmid。
qSH1基因突变体的制备：
将构建好的CRISPRCas9载体转化到AgrobacteriumtumefaciensEHA105菌株中。
通过电穿孔法将EHA105和水稻愈伤组织（P0707）共培养三天。
筛选愈伤组织中qSH1突变体，进行测序。
对qSH1基因突变体进行生物学特性分析：
将选出的qSH1基因突变体对照野生型水稻进行生物学特性分析。
统计突变体的农艺性状，如株高、生物量等；同时统计突变体的落粒性并进行比较分析。
结果与分析：
（1）CRISPRCas9对qSH1基因的敲除效果
实验结果显示，利用CRISPRCas9技术成功创制了qSH1基因突变体。对愈伤组织进行PCR扩增和测序分析，发现qSH1基因在部分突变体中发生了插入或缺失的突变。此外，突变体的“基因修复”情况明显较低。
（2）qSH1基因突变体的农艺性状
对qSH1基因突变体的农艺性状进行了统计分析，发现突变体的株高、生物量等性状在不同生长阶段存在显著的差异。其中，部分突变体早期生长速度较快，生物量较大；而部分突变体生长速度较慢，生物量较小。
（3）qSH1基因突变体的落粒性
对突变体的落粒性进行比较分析，发现突变体的落粒性明显出现了变化。部分突变体落粒率相对较高，而部分突变体落粒率则相对较低。这表明，qSH1基因的突变对水稻的落粒性具有重要的调控作用。
结论：
本研究成功地创制了水稻落粒性基因qSH1突变体，并对其进行了一系列突变特征分析。结果显示，CRISPRCas9技术能够对水稻落粒性基因qSH1进行有效的敲除，对突变体的落粒性、生长速度、生物量等性状具有显著的影响。这为今后继续开展水稻落粒性基因研究提供了重要的依据和基础。