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利用CRISPRCas9技术构建拟南芥多基因缺失突变体体系
摘要：
CRISPRCas9基因编辑技术是一种高精度、高效率的基因编辑技术，已经被广泛应用于不同模式生物中。本研究以拟南芥为研究对象，利用CRISPRCas9技术构建多基因缺失突变体系，以期探究基因相互作用与功能。通过设计CRISPR引物，对拟南芥中关键基因进行靶向敲除，经筛选检测，得到10个多基因缺失突变体系。进一步对这些突变体系进行表型、生长和发育分析，结果发现不同基因的缺失产生了明显的表型差异。在这些基因缺失突变体系上的基因表达谱分析表明，这些基因相互影响，关联与调控彼此。因此，本研究不仅为拟南芥的相关研究提供了可靠的基因编辑平台，同时也为构建其他植物的多基因缺失突变体系提供了基础。
关键词：
CRISPRCas9，拟南芥，多基因缺失突变体系，基因编辑，基因相互作用
引言：
拟南芥作为模式植物之一，已成为许多研究的热门对象。在植物基因组学领域，拟南芥的基因组已经被完全测序，并提供了种类丰富的遗传、生理和分子工具。基因编辑技术作为一种新型的遗传工具，在最近几年也被广泛应用于拟南芥基因功能研究。CRISPRCas9基因编辑技术由于其高精度、高效率的特点，已经逐渐成为研究者的首选。多基因缺失是生物进化和生命功能相关性的重要表征，因此研究拟南芥多基因缺失突变体系将为拟南芥基因相互作用和功能调控等方面的研究提供重要工具。因此，本研究以利用CRISPRCas9技术构建拟南芥多基因缺失突变体系为主线来探究拟南芥基因的相互作用与调控的机制。
材料与方法：
1、拟南芥生长：本研究使用拟南芥（Arabidopsisthaliana）Col-0ecotype，生长在25°C、16h光/8h暗的环境中。
2、有关引物设计：以GeneiousPrime(v2019.0.1)软件为工具，设计引物，针对不同基因的特异性敲除。Cas9目标序列为'NGG'，并在搜寻过程中筛选参数设定阈值值较高以确保引物的特异性。敲除效率仅计算在不损失正常结构的情况下，是否能够成功敲除目标基因。
3、构建质粒：将敲除特定基因的引物组成的阳性克隆插入到pCAMBIA2300二元载体中，用于导入拟南芥中。构建的质粒经过测序验证，批量显微注射进入拟南芥中。
4、PCR检测：使用已经开放的拟南芥基因组中心设定的PCR扩增方案进行基因敲除的筛选。在PCR扩增过程中，使用了比基因组中心设置的标准扩增条件稍为宽松的扩增条件来增加扩增效率。
结果：
1、设计基因敲除引物并构建质粒：
-针对拟南芥基因组中已知的10个关键基因设计目标引物，欲通过CRISPRCas9技术将其敲除。
-所设计的引物经序列验证后，将敲除特定基因的引物组成的阳性克隆插入到pCAMBIA2300二元载体中，用于导入拟南芥中。
2、CRISPRCas9突变体系的选育和分析：
-经筛选后，本研究共得到10个多基因缺失突变体系。这些突变体系中，一株突变体系含有多个基因敲除。
-通过表型及发育分析，发现不同基因缺失对植株生长和发育的影响存在显著差异。某些突变体系出现轻度至显著的生长抑制和器官发育延迟等不同程度的异常表型。
-在这些基因缺失突变体系上的基因表达谱分析表明，这些基因相互影响，关联与调控彼此。构建的多基因缺失突变体系成功避免了可能存在的同源基因互补或调节循环缺陷的影响，从而大大增加了对单个基因缺失的表型响应度和理解基因相互影响的能力。
结论：
本研究通过利用CRISPRCas9技术成功构建了多基因缺失突变体系，探究了基因相互作用机制。我们展示了基因编辑技术在拟南芥中作为探索基因功能、相互作用和调控的有力手段。通过构建多基因缺失突变体系，为人们揭示了一种更多方面的功能性机制和植物生长发育的控制机制。因此，本研究为构建其他植物的多基因缺失突变体系提供了新的基础。
参考文献：
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