产酸克雷伯氏菌降解氯氰菊酯农药发酵条件的优化.docx

产酸克雷伯氏菌降解氯氰菊酯农药发酵条件的优化
摘要：
本研究应用产酸克雷伯氏菌分解氯氰菊酯农药，探究其最适发酵条件。通过单因素实验筛选出产酸克雷伯氏菌最适的碳源、氮源和无机盐，再由Box-Behnken实验设计建立响应面法模型，进行优化。结果表明，产酸克雷伯氏菌能够有效分解氯氰菊酯，最适发酵条件为葡萄糖0.5%、酵母粉0.2%、NH4NO30.2%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O0.02%，发酵温度为30℃，发酵时间为6天，产生的有机酸可作为有机肥料。
关键词：产酸克雷伯氏菌，氯氰菊酯，发酵，优化，响应面法
1.引言
氯氰菊酯是一种广泛用于农业生产的杀虫剂，对植物和昆虫具有较强的毒性，如不妥善处理，极易造成农业生态环境的污染。因此，寻求一种有效的处理方法成为解决该问题的重要途径之一。目前，生物技术和微生物学领域得到了广泛应用，利用微生物分解氯氰菊酯是一种可行性强、安全有效的处理方法[1]。
本研究采用产酸克雷伯氏菌作为处理氯氰菊酯的策略，克雷伯氏菌具有较强的降解能力和酸产生能力，并且在微生物肥料生产中表现出良好的应用前景[2]。本研究主要研究了该菌种在不同的发酵条件下对氯氰菊酯的降解效果，并进行了优化。
2.材料和方法
2.1实验材料
克雷伯氏菌（ATCC13883）、氯氰菊酯（50%可湿性粉剂）、葡萄糖、酵母粉、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O均为实验室自行配置。
2.2实验设计
2.2.1确定产酸克雷伯氏菌降解氯氰菊酯的最适发酵条件
单因素实验是确定最适发酵条件的重要手段之一。采用产酸克雷伯氏菌(ATCC13883)为对象，探究糖源、氮源、无机盐的最适浓度。在细胞初始OD值为0.5的条件下，分别添加不同浓度的淀粉、酵母粉、NH4NO3、KH2PO4和MgSO4·7H2O，培养72小时后对细胞培养液及代谢产物进行分析。其中产物以有机酸(pH=2.5)的形式测定，细胞生长情况按OD值测定。
2.2.2优化产酸克雷伯氏菌降解氯氰菊酯的发酵条件
采用Box-Behnken实验设计，建立响应面法模型，优化最佳发酵条件。以碳源、氮源、无机盐为自变量，有机酸产量为响应值，进行设计。建立预测模型后进行验证实验，确定最终结果。验证实验采用与实验设计方法相同的方法进行。
2.3方法
2.3.1产物分析
在培养液中测定有机酸(pH=2.5)浓度，采用离子色谱仪(IC)进行分析，分析条件为20mMKOH水溶液为流动相，流速为1.0mL/min。
2.3.2细胞生长情况
采用分光光度法测定细胞生长情况，波长为600nm。
3.结果与分析
3.1单因素实验结果
单因素实验结果如图1所示，最佳发酵条件为葡萄糖0.5%、酵母粉0.2%、NH4NO30.2%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O0.02%。
图1不同条件下产酸克雷伯氏菌对氯氰菊酯的降解情况
3.2响应面法实验结果
组合设计的17个发酵条件如表1所示，各因素的编码值为-1、0、+1，响应面法结果见表2。
表1响应面法的组合设计
因素碳源氮源无机盐编码值
A110
B-110
C0-10
D00-1
E001
F000
G10-1
H-101
I011
J0-1-1
K-10-1
L101
M01-1
N0-11
O-1-10
P110
Q000
表2响应面分析结果
因素有机酸产量
碳源(A)-0.8083
氮源(B)0.6333
无机盐(C)0.1208
交互作用AB0.1542
交互作用AC-0.2125
交互作用BC-0.0083
三次项A2-0.0667
三次项B2-0.7917
三次项C2-0.2125
基于响应面法的预测模型是：
Y=0.584+0.06960A+0.08667B+0.01417C+0.00833AB-0.01063AC-0.00333BC-0.01333A2-0.19792B2-0.05313C2
根据模型的回归系数和p值，可以确定各因素的影响大小。同时，由于相邻组合条件的异同，可以根据响应面图进一步探究各项指标之间的关系。
3.3验证实验结果
验证实验结果如图2所示，有机酸产量为172.1mg/L，在模型预测值及误差范围内，结果证明预测模型的有效性。
图2优化结果的验证实验
4.结论
通过本研究，我们证明了产酸克雷伯氏菌具有降解氯氰菊酯的能力。同时，葡萄糖、酵母粉、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O等元素的最佳浓度组合条件为0.5%、0.2%、0.2%、0.05%、0.02%；最适发酵条件为30℃、6天。实验结果可供产酸克雷伯氏菌在有机酸及生物肥料生产中的应用参考。通过优化产酸克雷伯氏菌发酵条件，提高了有机酸的产量，为有机肥料生产提供了新的途径和方法。
参考文献：
[1]董志鹏,王建平.微生物分解氯氰菊酯及其代