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乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类
时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无
鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一.筛选方法：
1.溶钙圈法：
利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
2.溴甲酚绿指示剂法：
培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）
筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。
二.菌种的分离筛选
1.培养基：
★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用）
★★1.2牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐温0.05%CaCO315-20g/L溴甲酚绿0.01%PH（分离用）
★1.3番茄汁碳酸钙培养基：
酵母膏7.5g/L葡萄糖10g/L番茄汁100mL蛋白胨7.5g/LKH2PO42.0g/L吐温（分离用）
1.4葡萄糖20g/L酵母膏10g/L
1.5蛋白胨8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖13-15g/LKH2PO41.5-2.0g/L
MgSO40.3-0.5g/LMnSO4g/Lg/L
1.6蛋白胨0.8-1.0g/L糖蜜酵母膏3-5g/L玉米浆0.5-1.0g/L
KH2PO40.1-0.3g/LMgSO4葡萄糖8-10g/L
PH5.5-6.5（发酵或种子培养基）
★★1.7MRS培养基（分离培养计数用）
蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、
葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1L,pH6.5。（分离培养基），当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀,倒平板。
1.8BCP培养基（溴甲酚紫培养基）
乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000mlpH6.5-7.0（分离用）
1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒
精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏
1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，
倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
2.分离筛选：
2.1富集培养：取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.
2.2菌种分离纯化：
溶钙圈法：
富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12mlMRS培养基或麦芽汁培养基，凝固后再注入