蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程.docx

蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程
丁香园chrispp作品。一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。结果如下：图11:pET-32aA3未诱导，2:pET-32aA3未诱导，3:pET-32aA3诱导后，4:pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9%NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mLPBS（pH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。结果如下：图21:pET-32aA3诱导上清，2:pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。影响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG浓度，摇床转速等等，所以设定在低IPTG浓度下（0.1mmol/L），在不同温度，诱导时间下的表达对照：1）37℃250rpm5h2）30℃180rpm10h3）23℃90rpm30h过程：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的50mL+50mL+60mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。从60mL培养液中取10mL作为未诱导对照，标记3个50mLLB培养菌液：1、37℃250rpm5h2、30℃180rpm10h3、23℃90rpm30h都分5次取样：37℃每一小时取样一次（取10mL）编号为：371、372、373、374、37530℃每二小时取样一次（取10mL）编号为：301、302、303、304、30537℃每五小时取样一次（取10mL）编号为：231、232、233、234、235诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。SDS-PAGE检测：1、37℃M12345五个样的上清和沉淀2、30℃M12345五个样的上清和沉淀3、23℃M12345五个样的上清和沉淀4、以不同温度下的最优可溶表达做比较结果如下：图3：37℃条件下五个样的上清和沉淀1:371上清，2:371沉淀，3:372上清，4:372沉淀，5:373上清，6:373沉淀，7:374上清，8:374沉淀，9:375上清，10:375沉淀图4图4：30℃条件下五个样的上清和沉淀1:301上清，2:301沉淀，3:302上清，4:302沉淀，5:303上清，6:303沉淀，7:304上清，8:304沉淀，9:305上清，10:305沉淀图5：23℃条件下五个样的上清和沉淀1:231上清，2:231沉淀，3:232上清，4:232沉淀，5:233上清，6:233沉淀，7:234上清，8:234沉淀，9:235上清，10:235沉淀图6:不同温度下的最优可溶表达1:234上清，2:234沉淀，3:303上清，4:303沉淀，5:373上清，6:373沉淀，由图5可知：23℃条件下，明显的提高了上清目的蛋白的含量，并且，存在可溶表达平衡，即20个小时后，蛋白表达将以包涵体的形式存在，即不论如何改变条件，可溶表达已