2-蛋白翻译后修饰-泛素化.docx

分子机制研究套路（二）蛋白翻译后修饰-泛素化课题：蛋白A调节蛋白B泛素化和降解的研究1．概念介绍：大多数蛋白均需进行翻译后修饰来扩增蛋白质组的数量调节蛋白质的稳定性、分布和功能。翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、亚硝基化、氧化等等。泛素化是在蛋白质翻译后通过将泛素分子结合到靶蛋白上形成多聚泛素链带有多聚泛素链的靶蛋白可被26S蛋白酶体识别、降解。泛素是76个氨基酸的多肽片段包含7个赖氨酸残基允许同时发生聚泛素化反应。在赖氨酸-48聚泛素化会导致其通过28S蛋白酶体降解。然而赖氨酸-63可以改变细胞的功能包括运输和DNA修复。可见单一的泛素化会依据其作用位点的不同而产生不同的结果。它和泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）和蛋白酶体组成了泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-ProteasomeSystemUPS）。UPS是细胞内非溶酶体途径蛋白质降解通路不仅降解变性、异常或起短暂作用的蛋白质而且能降解转录因子、内膜蛋白和细胞周期蛋白等天然蛋白对于维持蛋白质稳定状态、调节细胞程序性死亡和控制细胞周期等过程有重要的作用。UPS还可作用于转录因子及体内的某些信号传导通路并参与细胞凋亡、主要组织相容性复合体抗原递呈、细胞周期以及细胞内信号传导等多个细胞生理活动对维持细胞正常生理功能具有重要意义。2．示意图：图1UPS的发生依赖于三种酶的参与。E1通过硫酯键将E1酶半胱氨酸与泛素分子连接在一起其能量来源于ATP水解作用；E2与泛素蛋白连接于激活的半胱氨酸位点；E3负责将泛素化蛋白与靶蛋白结合在一起3．研究思路：3.1蛋白A降低蛋白B的表达量33.1.1蛋白A介导蛋白B降解33.1.2蛋白A降解蛋白B的特异性33.1.3蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性33.1.4蛋白A调节蛋白B稳定性43.2蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统43.2.2蛋白B降解位于蛋白酶体系统43.2.3蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统53.3赖氨酸XXX位点为蛋白A介导蛋白B泛素化靶位点53.3.1蛋白A介导蛋白B泛素化53.3.2赖氨酸XXX位点为蛋白A介导蛋白B泛素化靶位点53.4蛋白A氨基端与羧基端在蛋白B降解中的作用63.4.1蛋白A氨基端与蛋白B降解63.4.2蛋白A羧基端与蛋白B降解63.4.3蛋白A羧基端与蛋白B泛素化63.1蛋白A降低蛋白B的表达量3.1.1蛋白A介导蛋白B降解蛋白A是泛素蛋白酶体系统中的一个调节分子。前期研究结果显示蛋白A可以调节蛋白B所在家族的某些分子的的泛素化和降解。为探讨蛋白A对于蛋白B的调节方式构建质粒蛋白A-V5和蛋白A-HA并将两种质粒分别转染HEK293细胞48小时后收集细胞采用Westernblot方法检测其蛋白表达水平结果如图3.1显示两种质粒转染HEK293后均可以下调HEK293细胞中内源性的蛋白B的表达。3.1.2蛋白A降解蛋白B的特异性为探讨蛋白A介导蛋白B降解的特异性我们将其他三种蛋白A的家族蛋白X、Y、Z转染HEK293细胞48小时采用Westernblot方法检测其蛋白B表达水平结果如图3.2显示X、Y、Z不能介导蛋白B的降解。3.1.3蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性检测蛋白B在若干肿瘤细胞中的基础表达。选择无内源性蛋白B的表达的细胞系（Cell1）采用该细胞系检测过表达蛋白B的稳定性。将蛋白B细胞共同转染蛋白A-V5/HA结果显示蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性。接下来为进一步检测蛋白A可以下调蛋白B的表达我们设计了三种不同的蛋白AshRNA（#1、#2、#3）并将其转染Cell1细胞48小时结果显示sh蛋白A可以增强蛋白B的表达进一步验证了实验结果。3.1.4蛋白A调节蛋白B稳定性为研究蛋白A介导蛋白B降解是否是因为其干预编码蛋白B的分子的mRNA的表达本实验采用RT-PCR方法检测蛋白A对蛋白BmRNA表达量的影响。将HEK293细胞分别转染空质粒或者蛋白A-V5质粒提取RNA而后设计蛋白B引物行RT-PCR检测。结果显示蛋白A对蛋白B的mRNA的表达无影响证实蛋白A介导蛋白B降解是通过调整其蛋白质的稳定性。3.2蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统3.2.1饥饿状态诱发蛋白B降解在研究蛋白A介导蛋白B降解的过程中我们发现Cell1细胞转染蛋白B-V5质粒后将细胞处于饥饿状态（FBS-free培养基）会降低细胞中蛋白B-V5的表达并且呈时间依赖性。3.2.2蛋白B降解位于蛋白酶体系统为研究蛋白B降解旁路我们将蛋白B-V5质粒转染后的CELL1细胞培养液中分别加入蛋白体酶抑制剂（MG-13220μM）和溶酶体酶抑制剂（Leupeptin100μM）观察不同时间（01h2h4h）蛋白B的降解情况。结果显示蛋白酶体