1-蛋白翻译后修饰- SUMO化.docx

分子机制研究套路（一）蛋白翻译后修饰-SUMO化课题：SUMO化A蛋白对B转录因子介导的C信号通路的调控1．概念介绍：蛋白质是生命活动中各种功能的执行者其功能正常与否决定着生命活动能否有序、高效的进行而其中蛋白质翻译后修饰起着至关重要的作用。蛋白质翻译之后翻译后修饰改变了蛋白质中氨基酸残基上的生物化学官能团进而改变其化学性质或结构使得蛋白质具有更为复杂的结构更为完善的功能更为精细的调节。蛋白质的翻译后修饰过程极其复杂已知的翻译后修饰种类有20多种。但其中较为常见的主要是泛素化、磷酸化、乙酷化、SUMO化、甲基化以及糖基化。类泛素（SmallUbiquitin-likeModifierSUMO)化修饰作为一种重要的翻译后修饰方式对蛋白质的功能有广泛的调节作用主要包括调节蛋白质的细胞定位蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的活性等方面。据研究报道在对SUMO化修饰的目的蛋白进行分析之后SUMO化修饰主要发生在保守序列ΨKXE中的赖氨酸位点K上。Ψ表示脂肪族氨基酸更倾向于亮氨酸L、异亮氨酸I、缴氨酸V。2．示意图：SUMO化修饰过程与泛素化类似包含E1活化酶E2结合酶和E3连接酶三个酶的级联反应。SUMO在最初合成时是一种前体形式像泛素一样需要蛋白剪切酶进行活化加工形成能够结合到底物赖氨酸上的异构肽键。在啤酒酵母中这一过程的剪切酶为Ulpl。C端成熟的SUMO首先由SUMO活化酶E1所活化E1是异二聚体蛋白复合物由Uba2和Aosl所组成。活化过程需要ATP的参与通过SUMO腺苷中间体将SUMO与Uba2上的半胱氨酸残基通过硫酯键连接起来。活化后的SUMO接下来被转移到SUMO结合酶E2Ubc9的半胱氨酸残基上SUMO连接酶E3结合并催化SUMO连接到底物蛋白上。不同的SUMO化修饰底物有不同的SUMO连接酶E3而Ubc9则能够与各种底物蛋白相结合。去SUMO化修饰反应是由具有异构酶活性的Ulpl和Ulp2蛋白所执行的。SUMO连接酶E3主要有三大家族:PIAS、RanBP2和PC2他们都能与Ubc9相互作用促进SUMO化修饰。图：SUMO化修饰与去SUMO化修饰循环3．研究思路：3.1A蛋白与B转录因子间相互作用的确定33.1.1在cell-1细胞中A蛋白和B转录因子间存在相互作用33.1.2A蛋白和B转录因子相互作用的进一步确证（外源表达）43.1.3A蛋白和B转录因子在cell-1细胞中的分布（免疫荧光共定位）43.1.4A蛋白激活B转录因子介导的下游靶元件xxx报告基因活性43.1.5A蛋白对B转录因子的转录激活具有剂量依赖性53.1.6A蛋白被干扰后抑制B转录因子的转彔激活能力53.2A蛋白的SUMO化修饰研究53.2.1A蛋白SUMO化的确定53.2.2A蛋白SUMO化位点的确定63.2.3A蛋白的SUMO化位点突变体降低了其转录活性63.2.4SENP1作为A蛋白的去SUMO化酶抑制A蛋白的转录活性73.2.5SUMO化影响了A蛋白在细胞中的定位73.3A蛋白的SUMO化影响了其与B转录因子间的相互作用83.3.1A蛋白SUMO化位点突变体降低了其与B转录因子间的相互作用83.3.2SENP1降低了A蛋白与B转录因子间的相互作用83.4A蛋白的SUMO化增强了其对B转录因子的辅激活能力83.4.1A蛋白的SUMO位点突变体降低了其对B转录因子的辅激活能力83.5SUMO化A蛋白促进cell-1细胞C信号通路的激活93.5.1SUMO化A蛋白增强了B转录因子下游靶基因E的转录水平93.5.2A蛋白促进cell-1细胞的增殖93.1A蛋白与B转录因子间相互作用的确定3.1.1在cell-1细胞中A蛋白和B转录因子间存在相互作用据文献报道A蛋白可能是B转录因子的一个辅助激活因子因此首先通过免疫沉淀方法研究二者之间是否可发生相互作用。选择内源性同时表达A蛋白和B转录因子的细胞系cell-1将经过D刺激处理后的细胞裂解液中加入A蛋白抗体或同源免疫球蛋白IgG(阴性对照)进行沉降用B转录因子抗体进行免疫印记结果表明二者具有相互作用。注释：1）免疫沉淀试验需要双方向共同验证即：还需要加入B转录因子抗体或同源免疫球蛋白IgG(阴性对照)进行沉降用A蛋白抗体进行免疫印记结果需与前述一致。2）D刺激是可以使B转录因子被激活的外源性刺激可以是药物、细胞因子、低温、高盐等条件。3.1.2A蛋白和B转录因子相互作用的进一步确证（外源表达）为进一歩验证A蛋白与B转录因子间的相互作用接下来在cell-2细胞内（最好为A蛋白或B转录因子阴性者）通过外源转染带有HA标签的B转录因子和Flag标签的A蛋白检测二者在cell-2细胞中受D刺激后是否存在相互作用。以Flag标签抗体沉淀A蛋白然后用HA标签