动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱一质谱质谱法.docx

动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱一质谱/质谱法
1原理
试样中氨基糖苷类药物残留，采用磷酸盐缓冲液提取，经过C18固相萃取柱净化，浓缩后，使用七氟丁酸作为离子对试剂，高效液相色谱一质谱/质谱测定，外标法定量。
2试剂和材料
2.1甲醇：液相色谱级。
2.2冰乙酸：液相色谱级。
2.3甲酸：液相色谱级。
2.4七氟丁酸：纯度≥99%。
2.5浓盐酸。
2.6氢氧化钠。
2.7三氯乙酸：纯度≥99%。
2.8乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)：纯度≥99%。
2.9磷酸二氢钾。
2.10七氟丁酸溶液(HFBA)：100mmol/L，准确量取6.5mL七氟丁酸((2.4)，用水稀释至500mL(4℃避光可保存6个月)。
2.11七氟丁酸溶液：20mmol/L准确量取100mmol/L七氟丁酸溶液50mL(2.10)，用水稀释至250mL(4℃避光可保存6个月)。
2.12磷酸盐缓冲液(含0.4mmol/LEDTA和2%三氯乙酸溶液)：准确称取磷酸二氢钾(2.9)1.36g，用980mL水溶解，用1.0mol/L的盐酸调pH到4.0，分别加人Na2EDTA(2.8)0.15g和三氯乙酸(2.7)20g，溶解混匀并定容至1000mL(4℃避光可保存1个月)。
2.13甲酸：0.1%(体积分数)，准确吸取1.0mL甲酸(2.3)于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
2.14壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素、新霉素标准品：纯度范围92.0%～99%。
2.1510种氨基糖苷类药物标准贮备液：分别准确称取适量的每种氨基糖苷类药物标准品(2.14)，用水溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准贮备溶液（4℃避光可保存6个月)。
2.16l0种氨基糖苷类药物混合标准中间溶液：分别准确量取壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素标准贮备溶液(2.15)各1.0mL，新霉素、潮霉素B、安普霉素标准贮备溶液((2.15)各5.0mL，于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素浓度为4.0μg/mL，新霉素、潮霉素B和安普霉素浓度为20.0μg/mL的混合标准中溶液(4℃避光可保存1个月)。
2.1710种氨基糖苷类药物标准工作溶液：精密量取标准中间溶液（2.16）适量，用用空白样品基质配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液(现用现配)。
2.18固相萃取C18柱：500mg,3mL。
3仪器
3.1高效液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。
3.2高速组织捣碎机。
3.3均质器。
3.4旋转蒸发器
3.5氮吹仪。
3.6pH计。
3.7分析天平：感量0.1mg和0.Olg各一台。
3.8真空泵。
3.9离心机。
4试样制备与保
4.1试样制备
样品经高速组织捣碎机均匀捣碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后标记，一份作为试样，一份作为留样。
4.2试样的保存
将试样于-18℃下保存。
5测定步骤
5.1提取
称取约5g(精确至0.01g)试样于50mL聚丙烯离心管中，加入10.0mL磷酸盐缓冲液((2.12)均质2min，于平板振荡器上振荡提取10min，离心10min(4500r/min)，将上清液转移到另一个50mL聚丙烯离心管中。在残渣中再加人10.0mL磷酸盐缓冲液(2.12)，重复上述操作，合并上清液，用1.0mol/L的盐酸调pH值为3.5士0.2，加人2.0mL七氟丁酸溶液(2.10)，涡旋混匀。
5.2净化
C18固相萃取柱用3.0mL甲醇(2.1)，3mL七氟丁酸溶液(2.11)淋洗后，将提取液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s，先用3mL七氟丁酸溶液(2.11)淋洗，再用每次3mL水淋洗两次，弃去淋洗液，抽干5min。用5mL乙腈一七氟丁酸溶液(2.11)(80-+20，体积比)洗脱，收集洗脱液于精密刻度试管中，40℃氮气流挥去部分溶剂，用七氟丁酸溶液(2.11)定容至1.0mL,涡旋混匀后，过0.2μm微孔滤膜，液相色谱一质谱/质谱测定。
5.3测定
5.3.1标准工作曲线制备
制备混合标准浓度系列，壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素分别为50ng/mL，100ng/mL，250ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，新霉素、潮霉素B、安普霉素分别为300ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，1500ng/mL，2000ng/mL，按5.3.2条件测定并制作标准曲线，10种氨基糖苷类药物的CAS号和在5.3.2色谱条件下测得的色谱保留时间参见表B.1。