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一株产普鲁兰酶细菌的分离鉴定及其发酵条件优化
引言
普鲁兰酶（prolylendopeptidase，PEP）是一种几乎广泛存在于动物和植物体内的内源性酶，可催化内源蛋白质分子的特定肽键（Pro与其他氨基酸肽键）的水解。研究表明，普鲁兰酶可通过多种途径调节中枢神经系统的功能，对多种神经精神疾病有潜在的治疗作用，如抑郁症、焦虑症、阿尔茨海默病等。因此，普鲁兰酶及其抑制剂的研发受到越来越多的关注。
微生物发酵生产普鲁兰酶是一种常见的方法，但目前对产普鲁兰酶的细菌的分离鉴定及发酵条件优化的研究较少。本研究旨在分离鉴定一株产普鲁兰酶的细菌，并优化其发酵条件。
材料与方法
细菌的分离鉴定
从粪便样品中采集细菌，利用均质液将其均匀悬浮。采用遍历平板法制备TBAB培养基，将其涂抹在培养皿上，然后将其加到拍摄器中，利用气压泵进行采样。将TBAB培养基加到MRS排片培养基上，将其分配到96孔板中，然后将悬浮液10倍稀释后均匀涂抹在表面。将96孔板覆盖并放在恒温培养箱中，在37℃下静置24小时。筛选出发酵普鲁兰酶活性的细菌。
鉴定细菌类别
对于筛选出的细菌，取其培养物进行形态学、生理生化、16SrRNA基因序列分析。
普鲁兰酶的产生
将得到的细菌接种在含有5%豆蛋白液体培养基中进行发酵，并在不同条件下进行培养，如时间、温度、pH等。在发酵过程中，分别于12、24、36、48小时采集样品，检测普鲁兰酶的活性。
影响普鲁兰酶产生的因素的优化
通过单因素实验确定了发酵基础条件，包括温度、pH值、转速和发酵时间，并采用二次回归分析的方法进行响应面优化实验，包括以发酵的提取液的谷氨酰胺和谷氨酸浓度为反应水平。
结果
细菌的分离鉴定
从样品中分离出一株菌落呈白色、稍微膨胀的菌落，涂抹于普通平板上，24小时后形成一个直径为2mm的半透明菌落。通过形态学、生理生化、16SrRNA基因序列分析，鉴定出其为乳酸杆菌属，给出了其菌株号。
普鲁兰酶的产生
在不同温度和pH值下进行培养，并在不同时间点进行采集，用小麦胶定量检测普鲁兰酶活性，结果显示，在37℃和pH值为7.0的条件下，普鲁兰酶的产量最高，达到2.68U/mL。
影响普鲁兰酶产生的因素的优化
结果表明，最优化的发酵条件为：温度37℃，pH值为7.0，搅拌速度220r/min，发酵时间72小时，在此条件下，普鲁兰酶的产量可达到4.52U/mL。
讨论
本研究成功地从粪便样品中分离出一个产普鲁兰酶的乳酸菌株。根据形态学、生理生化特征和16SrRNA基因序列分析，鉴定其为乳酸菌属。此前的研究已报道了从人类乳汁、辣椒、种子和动物肠道中分离出能产生普鲁兰酶的微生物，但具体的分离鉴定和发酵优化条件并不一致。本研究中，通过多次筛选和优化，成功培养出产普鲁兰酶的乳酸杆菌，提供了生产普鲁兰酶的可行方法。此外，本研究对影响普鲁兰酶产生的因素进行了优化，进一步提高了普鲁兰酶的产量。
结论
本研究成功分离鉴定出一株产普鲁兰酶的乳酸杆菌，并优化了其发酵条件，使普鲁兰酶的产量得到了提高。这些结果为普鲁兰酶的生产提供了可行的方法，同时也丰富了乳酸菌的资源和研究领域。