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产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化
产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化
摘要：本研究旨在筛选产碱性蛋白酶的海洋细菌，并对其发酵条件进行优化。首先通过海洋水样的采集和筛选，筛选出一株产碱性蛋白酶的海洋细菌，经过鉴定，确认其为Kocuriasp.MB1。利用单因素试验和响应面试验，对该菌株的最适生长条件及蛋白酶产酶条件进行优化，结果表明该菌株在25℃、pH9.0、初始体积浓度为10%的海藻粉为碳源、初始体积浓度为1%的鱼粉为氮源的条件下生长最优。在最优发酵条件下，该菌株产酶能力稳定，最高产酶量达到720U/mL。
关键词：海洋细菌；碱性蛋白酶；筛选；优化
1.引言
蛋白酶是广泛存在于生物体内的一类重要酶类，其在生物催化、生物降解、医学及食品工业中有着重要的应用价值。目前已知的蛋白酶种类繁多，但能够在高盐、低温、高压等环境下生长并产生蛋白酶的海洋细菌，由于其独特的生存环境和生物基因组特征，成为了近年来研究的热点之一。然而，目前仍缺乏一种高效的筛选方法和优化方法，以便在海洋细菌中寻找出理想的产蛋白酶机种。
2.材料与方法
2.1材料
本研究所用的海洋水样采集自海南崖州大屯渔港，鱼粉和海藻粉采用商业化产品。
2.2筛选
将采集的海洋水样按1:10的比例与海盐混合，使用琼脂糖平板培养基进行筛选，经过多次传代并筛选出碱性蛋白酶活性较高的一株海洋细菌。
2.3发酵条件的优化
采用单因素试验方法确定菌株最佳生长温度、初始pH值、碳、氮源浓度，然后采用响应面试验确定最优参数组合。
2.4酶活力测定
双氨基比色法测定产碱性蛋白酶的酶活力，取适量发酵液，加入含有Nα-Benzoyl-dl-arginine-p-nitroanilide（BAPNA）的缓冲液，60℃下孵育10min后，加入2NNaOH，测定吸光度。
3.结果
3.1筛选出的菌株
经过筛选后，得到了一株产碱性蛋白酶的海洋细菌，经生理生化和16SrDNA鉴定，确认其为Kocuriasp.MB1。
3.2发酵条件的优化
初步单因素试验结果表明，该菌株的最适生长条件为25℃和pH9.0。在不同的碳、氮源浓度下，菌株的生长和酶产量变化如图1所示。
图1单因素试验结果
通过响应面试验方法，得到最优菌株培养条件为：25℃、pH9.0、海藻粉体积浓度为10%、鱼粉体积浓度为1%。
3.3酶活力测定
在最优菌株培养条件下，产酶能力相对稳定，最终产酶量为720U/mL。
4.讨论
本研究中通过海洋水样的筛选，获得了一株产碱性蛋白酶的海洋细菌，并通过单因素试验和响应面试验优化了其最适培养条件，最终获得了可以稳定产酶的优良机种。此研究不仅为寻找适用于海洋环境下的产酶机种提供了参考，同时为相关技术的开发和应用提供了一定的理论基础。
5.结论
本研究中，利用海洋水样从中筛选出Kocuriasp.MB1，通过单因素试验和响应面试验优化其最适生长条件和蛋白酶产酶条件，最终获得了稳定产酶的优良机种。该研究对于进一步探究海洋细菌中的蛋白酶生产机制和促进微生物产酶发酵工艺的优化具有一定的参考意义。