壬基酚和双酚A检测方法.docx

1目的
建立该程序为规范壬基酚和双酚A测定提供指导性文件。
2适用范围
本规程适用于婴幼儿食品及食用植物油和包材等双酚A、壬基酚含量的液相色谱-串联质谱法测定。
3原理
试样中(婴幼儿乳粉及粉状原料）的壬基酚和双酚A经乙酸乙酯-环己烷（体积比按1:1）提取后，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。
样品（油类）经过凝胶渗透色谱法（GPC）除脂净化（乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v）超声提取），同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。
样品（膜）经过正己烷浸泡提取，氮吹（42℃）至干，用1ml甲醇定容后，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。
4试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。
乙酸乙酯
环己烷
壬基酚和双酚A及其同位素内标（NP-d4、BPA-d4）
甲醇
氨水（分析纯）
乙腈
标准溶液
壬基酚和双酚A标准储备液（ml）：分别称取壬基酚和双酚A的标准品（精确到），溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4℃冰箱中。
壬基酚和双酚A标准中间夜（2ug/ml）：分别吸取1ml壬基酚和双酚A标准储备液，用甲醇定容至100mL。
壬基酚和双酚A标准工作液：分别吸取壬基酚和双酚A标准中间夜10μl，25μl，50μl，75μl，100μl，150μl，250μl，然后分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液，最后加甲醇定容至1ml，配制成工作液浓度分别为20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml，200ng/ml，300ng/ml，500ng/ml。
内标物溶液
壬基酚和双酚A同位素内标物标准储备液（ml）：分别称取壬基酚和双酚A的同位素内标物（精确到），溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4℃冰箱中。
壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液（2ug/ml）：分别吸取1ml壬基酚和双酚A的同位素内标物标准储备液，用甲醇定容至100mL。
5仪器和设备
天平：感量为。
涡旋振荡器
氮吹仪
低温低速离心机
超高效液相-质谱联用仪
凝胶渗透色谱仪
6分析步骤
试样处理
婴幼儿乳粉及粉状原料
称取试样1g（原料根据实际情况酌情减少称样量）精确到于50ml干燥的玻璃离心管中，向样品中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素（200ng/ml）内标物（NP—4-n-NP-d4和BPA-d4）,加入8ml乙酸乙酯-环己烷溶液（体积比按1:1），涡旋振荡30s，离心10min（1000转/min）。然后再重复上述操作进行第二次提取，将两次的上清液合并至同一个试管中。然后将上清液转移到氮吹管中，进行氮吹（42℃），吹干后用1ml甲醇进行定容，用有机滤膜过滤后上机，同时做试剂空白试验。
包材
准确裁取一定面积（15*30cm）的包材，然后进行塑封，向其中加入100ml的正己烷进行浸泡，向浸泡液中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素（1ug/ml）内标物（NP—4-n-NP-d4和BPA-d4）.浸泡5小时，每隔半个小时摇晃一次。取出20ml浸泡液于干净的试管中进行氮吹（42℃），吹干后用1ml甲醇进行定容，同时做试剂空白试验。用有机滤膜过滤后上机。
食用植物油
称取食用植物油样品g于GPC样品管中，向样品中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液（200ng/ml）,加入5mL乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v），2000rpm涡旋混合1min，用于GPC净化。GPC分离采用苯乙烯树脂BiobeadSX-3(300×10mm)凝胶色谱柱，流动相为乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v），流速mL/min。收集14-17min组分于100mL茄形瓶中，30oC，120rpm旋转蒸发至干，1mL甲醇（）定容，用有机滤膜过滤后上机，同时做试剂空白试验。
测定
参考液相色谱条件
色谱柱：WatersACQUITYUPLCTMBEHC18柱（50mm×mm）；捕集柱：WatersIsolatorColumn（P/N：6），捕集柱位于进样阀之前（图1）。
流动相:甲醇﹪氨水
进样量：10μl
流速：min
柱温：35±5℃
样品室温度：15±5℃
根据仪器性能调至最佳状态，液相仪器参考条件见下表
目标化合物参考液相色谱条件
时间（min）流速（ml/min）A%（甲醇）B%%氨水溶液)4060100021000406034060参考质谱条件
质谱条件：离子源，电喷雾电离ESI（-）；毛细管电压，KV；离子源温度，150oC；脱溶剂温度，400oC；脱溶剂气流量，800L/h；锥孔气流量为50L/h。采用多反应