趋化因子生物活性的测定.pdf

趋化因子生物活性的测定--趋化因子生物活性的测定趋化因子生物活性的测定1.基本原理：趋化因子的趋化作用没有种属特异性趋化因子的靶细胞主要有中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞和成纤维细胞等。（以IL-8为例）IL-8是典型的CXC家族趋化因子对嗜中性粒细胞和T淋巴细胞有趋化作用。由于它的趋化作用没有种属特异性因此可以用豚鼠嗜中性粒细胞代替人嗜中性粒细胞对其进行活性检测。趋化因子诱导的细胞移动方式有两类：化学增活现象指增强细胞的随机运动琼脂糖小滴化学动力实验是检测这种活性的比较简易快速重复性好的方法。趋化性指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向移动。琼脂糖中的趋化实验和微孔小室中的趋化实验则是常用的测定细胞因子趋化活性的方法。微孔小室中的趋化实验：微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移穿过一定孔径的滤膜而设计的。滤膜将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面趋化因子在下面趋化因子通过滤膜形成梯度细胞则沿着梯度穿过膜孔黏附在膜的下面染色并计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。趋化材料和趋化时间的选择：趋化滤膜的材料和孔径需根据靶细胞的大小选择；中性粒细胞用3μm孔径的PVPF聚碳酸膜（Polycarbonatemembranes）趋化时间为30分钟；单核细胞用8μm孔径的PVPF聚碳酸膜趋化时间为90分钟；粘附力弱的淋巴细胞则用下表面复以明胶或纤粘素的5μm或8μmPVPF聚碳酸膜以免淋巴细胞穿过膜后落入下室趋化时间为180分钟。趋化因子浓度的确定：趋化因子生物活性的测定--趋化因子生物活性的测定--由于趋化因子的特异活性非常高某些趋化因子在较高浓度时促进细胞趋化的作用反而降低所以待测样品常需连续稀释（5倍或10倍系列稀释）以获得最适剂量的趋化结果。每次实验都需设好对照因为不同来源或不同活力靶细胞的趋化能力差异很大。趋化因子活性的表达方式有三种其中最常用的是用趋化指数表示趋化指数（chemotacticindexCI）是指细胞迁移到待测样品液的数目和迁移到对照液的数目的比值。2.试剂和材料：纯化的IL-8注射器离心管移液器Tip头0.17%D(+)-糖原/生理盐水解剖器械（剪刀镊子止血钳）17%D(+)-Glycogen趋化小室趋化滤膜细胞刮子计数板显微镜玻璃片红细胞裂解液：0.17MTris0.16MNH4CL将10ml0.17MTris加至90ml0.16MNH4Cl中调至PH7.2甲醇Gimsa染色液Hanks使用液RPMI1640豚鼠中性粒细胞3.实验程序：一．豚鼠嗜中性粒细胞的制备：1）取成年豚鼠1只腹腔注射含0.17%糖原的生理盐水13小时后用PBS缓冲液冲洗腹腔收集腹腔液1500rpm/min10min弃上清。2）轻轻弹起沉淀用3-5mlPH7.2的37oC预温的（Tris-NH4CL）红细胞溶解液