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彩色棉查尔酮合成酶基因GhCHS1的克隆和功能分析
彩色棉查尔酮合成酶基因GhCHS1的克隆和功能分析
摘要：
彩色棉是一种独特的棉花品种，其花瓣和纤维具有彩色素的合成能力。查尔酮合成酶（CHS）是彩色素合成的关键酶，参与了花瓣中花青素的合成。本研究对彩色棉的CHS基因进行了克隆与功能分析，以期揭示彩色棉花瓣颜色形成的分子机制。
引言：
花瓣颜色是花卉吸引昆虫传粉的重要特征之一。在花青素的合成途径中，查尔酮合成酶是转换苯丙状亚油酸为查尔酮的关键酶。近年来，研究发现彩色棉中花青素的含量显著增加，获得了丰富的花瓣颜色。因此，彩色棉成为研究花色形成机制的理想材料之一。本研究旨在克隆彩色棉中的CHS基因并进行功能分析，以期揭示彩色棉花色形成的分子机制。
材料与方法：
1.实验材料
本研究选取彩色棉花品种进行实验，包括白色棉花与红色棉花。
2.RNA提取与cDNA合成
从彩色棉的花瓣组织中提取总RNA，使用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。
3.CHS基因的PCR扩增与克隆
设计特异引物，使用cDNA为模板进行PCR扩增，得到CHS基因的DNA片段。
4.转化与表达
将CHS基因克隆到表达载体中，通过冷冻存储的方法将表达载体导入大肠杆菌中，然后诱导表达。
5.功能分析
通过重组表达的CHS蛋白，进行酶活性测定、底物亲和性测定和底物特异性测定。
结果与讨论：
1.CHS基因的克隆
通过PCR扩增和克隆，成功从彩色棉中克隆得到了CHS基因的DNA片段。
2.CHS基因的表达
将CHS基因克隆到表达载体中，成功转化到大肠杆菌中并进行了诱导表达。Westernblot结果显示，转化株中的蛋白中含有CHS蛋白。
3.CHS酶活性测定
通过对重组表达的CHS蛋白进行酶活性测定，发现其具有查尔酮合成酶的活性，能够催化苯丙状亚油酸转化为查尔酮。
4.CHS底物亲和性测定
通过测定CHS对不同底物的反应活性，发现其对苯丙状亚油酸具有较高的亲和性。
5.CHS底物特异性测定
对CHS基因进行序列比对发现，其蛋白序列在查尔酮合成所需的保守区域与其他植物物种的CHS基因具有高度同源性，在底物特异性的分析中也获得了支持。
结论：
通过本研究，我们成功克隆并进行了功能分析彩色棉中的CHS基因，发现其具有查尔酮合成酶的活性，对苯丙状亚油酸具有高亲和性。这些结果揭示了彩色棉花色形成的分子机制中CHS基因的重要作用，为进一步研究彩色棉花青素合成提供了重要的基础。
参考文献：
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3.ZhangL,WeiJ,etal.CloningandfunctionalanalysisofaflavonolsynthasegenefromEpimediumsagittatum[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2014,451(4):602-607.