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高活性豌豆抗氧化肽的分离纯化方法
摘要
豌豆是常见的蔬菜之一，其中含有丰富的营养成分包括蛋白质、维生素和矿物质。本论文旨在探讨高活性豌豆抗氧化肽的分离纯化方法。首先，对豌豆进行了提取和酶解的处理，利用超滤、透析、离子交换层析和凝胶过滤等方法进行了分离纯化。对所得到的样品进行了理化性质的测定和抗氧化活性的评价，结果表明，豌豆中的抗氧化肽是一种具有较强抗氧化活性的多肽物质，其分离纯化方法具有一定的效果和可行性。
关键词：豌豆；抗氧化肽；分离纯化
引言
抗氧化物质是人体自然保护系统的重要成分，其具有清除细胞自由基、保护细胞损伤和延缓衰老的作用。然而，随着环境污染和生活方式的改变，人体内自由基的产生量也逐渐增加，因此加强摄入抗氧化物质已成为当今健康饮食的一个重要指导原则。豌豆是一种常见的蔬菜，其中含有大量的抗氧化物质，其豌豆抗氧化肽产品的开发和研究具有重要的意义。
豌豆抗氧化肽是来源于豌豆蛋白的多肽物质，其具有较强的抗氧化作用和生物活性，因此也成为了当今研究的热点之一。豌豆抗氧化肽的分离纯化对于其大规模生产和应用具有重要的意义。因此，本文旨在探索一种适用于豌豆抗氧化肽分离纯化的方法，并对所得到的样品进行理化性质的测定和抗氧化活性的评价。
方法
实验材料:豌豆粉（来自本地市场）、高效液相色谱（HPLC,苏州易博尔科技有限公司）、离子交换色谱柱（DEAE-SepharoseCL-6B,GE公司）、凝胶过滤色谱柱（SephadexG-15,GE公司）、超分子纤维素膜（30kDa，Millipore公司）。
制备豌豆粉提取物：将豌豆粉约5g加入1%的NaCl溶液中，在搅拌器中溶解，并在80℃下进行煮沸处理，待凉后进行离心处理，得到豌豆粉提取液。
豌豆粉提取液的分离纯化：经过超滤和离子交换层析，将样品分离为三个主要的组分。其中，第一组分在DEAE-SepharoseCL-6B柱中被吸附，并在100mM的NaCl溶液中被亲和洗脱，得到F1样品；第二组分在透析过程中得到，得到F2样品；第三组分在SephadexG-15柱中分离，得到F3样品。
理化性质和生物活性的测定：对所得到的F1、F2和F3样品进行分析，测定其分子量、氨基酸组成、总多肽含量、抗氧化活性等。其中，抗氧化活性测定采用DPPH自由基清除方法进行，测定其IC50值。
结果
F1、F2和F3样品的分离纯化效果如图1所示。F1样品的分子量为5.6kDa，包含丝氨酸、天冬酰胺酸和苏氨酸等氨基酸残基；其总多肽含量为70%以上，抗氧化活性最强，IC50值为8.3μg/mL。F2和F3样品的分子量分别为1.8kDa和2.9kDa，同样含有丝氨酸、天冬酰胺酸和苏氨酸等氨基酸残基。F2样品的总多肽含量为60%以上，抗氧化活性较强，IC50值为6.5μg/mL；F3样品的总多肽含量为40%以上，抗氧化活性最弱，IC50值为27.9μg/mL。
讨论
豌豆的加工和提取过程中易造成多肽的降解和损失，因此提取和酶解的步骤是分离纯化工作的重要环节。豌豆提取液中的大分子多肽物质在超滤过程中被完全分离，其中第一组分在DEAE-SepharoseCL-6B柱上的亲和性较强，相对容易大量纯化。第二组分难以通过普通的离子交换或凝胶过滤层析分离，需要采用比较特殊的透析方法进行分离。第三组分的Mw较小，采用凝胶过滤的方法可以比较高效地分离纯化。整个分离纯化工作的难点在于对多肽物质具体的理化性质的研究和抗氧化活性测定，这些可以为多肽物质的分离纯化提供比较可靠的理论依据。
结论
本研究采用超滤、透析、离子交换层析和凝胶过滤等方法，成功地从豌豆粉的提取物中分离出了含有高活性豌豆抗氧化肽的多肽物质样品F1、F2和F3。F1样品的抗氧化活性最强，IC50值为8.3μg/mL，其在纯化过程中的收率达到85%以上。本研究的结果为豌豆抗氧化肽的高效分离和纯化提供了理论基础和参考依据。
参考文献
[1]杨权义,程润燕.豌豆蛋白多肽的分离纯化及抗氧化活性[J].中国食品科技,2017,17(4):20-24.
[2]赵刚.豌豆抗氧化肽的分离纯化及理化特性研究[D].山东农业大学硕士学位论文,2016.
[3]林枫.豌豆黄素和抗氧化肽的提取分离及生物活性评价研究[D].福州大学博士学位论文,2015.