细胞表面分子的检测与分析详解演示文稿.ppt

细胞表面分子的检测与分析详解演示文稿优选细胞表面分子的检测与分析流式在细胞表面分子检测中的应用标本来源标本制备标本制备四、贴壁细胞单细胞悬液的制备
（1）将培养细胞用0.04％EDTA或0.25％胰酶消化3～7分钟，
至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化
液，加PBS；
（2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中；
（3）离心，1000r/min，5min；
（4）加PBS洗两遍；
（5）PBS重悬，将细胞吹打均匀；
（6）荧光标记。标记方法对照设置同型对照（IsotypeControl）双色标记荧光补偿荧光补偿对照注意事项样本的采集样本的储存样本的染色溶血，即裂解红细胞。它是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好分开，溶血好坏直接影响检测结果。因此，必须对溶血过程进行严格控制。
结语常用的荧光染料参考书籍实验：人外周血T淋巴细胞亚群的检测与分析淋巴细胞T淋巴细胞(CD3+)活化T淋巴细胞实验分组1.取4只FCM测量管，编号blank、CD3、CD4、CD3\CD4，各管内加入100μl新鲜抗凝血；
2.直接标记法：各管内加入相应的荧光标记抗人的单克隆抗体2ul，充分混匀，闭光孵育20～30min；
3.溶血。ACK溶血剂:加入500μlACK溶血剂，充分混匀，反应10min,1500r/min离心5min，去上清，PBS洗1次；若红细胞存留较多，再重复溶血一遍。收集细胞上机检测。ABC溶血剂配方ACK溶血剂配方荧光补偿“A门”内CD3/CD4的表达“A门”位置变化引起的改变“A门”位置变化引起的改变小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达流式检测胞内细胞因子步骤6、溶血。各管内加入1mlBD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。
7、固定。各管内加入500μl2%PFA固定剂，4℃避光固定30min。1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗两次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。
8、透膜。各管内加入500μl透膜液，4℃避光10～15min。1800rpm*5min离心去上清。
9、封闭。6、7号管加入25μl封闭液。（5μl小鼠血清+20μl10%BSA)4℃避光30min。
10、胞内染色。6号管内加入同型对照抗体FITC-mIgG1和PE-mIgG1各2μl；7号管内加入抗体FITC-IFNg和PE-IL17各5ul。4℃避光染色30min后透膜液500μl/管洗一次,SB染色缓冲液1ml/管再洗一次。
11、上机检测。2%PFA固定剂300μl/管混匀重悬4℃放置待检。现在是39页\一共有40页\编辑于星期日流式检测外周血Treg细胞步骤