人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞.docx

人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞[摘要]目的：探讨人骨髓基质干细胞体外定向诱导成骨细胞的培养方法为应用人骨髓基质干细胞进行骨科细胞治疗提供依据。方法：抽取人骨髓组织梯度离心后置于含100ml/L小牛血清的DMEM培养液中培养24h换液待细胞完全贴壁融合长满瓶底后胰酶消化传代换诱导培养基继续培养、扩增。倒置显微镜观察细胞的形态结合细胞化学染色、免疫组织化学染色进行细胞鉴定以及采用细胞增殖法(MTT比色试验)分别于1、2、4、6、8d测细胞OD值绘制细胞生长曲线。结果：传代细胞4～5d即可传代在诱导培养基中2周形成多层结构并聚集成黑色结节。培养细胞ALP染色强阳性Ⅰ型胶原免疫组化染色呈黄褐色细胞在接种后3～6d增殖最快。结论：本实验方法应用骨髓基质干细胞体外定向诱导所培养的细胞符合成骨细胞的形态特征和生物学特性。[关键词]骨髓基质干细胞；细胞培养；成骨细胞[中图分类号]R-33[文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2008）01（b）-041-02近年来干细胞的体外培养扩增和定向诱导分化取得了较大进展越来越多的研究证明骨髓基质干细胞可定向地向成骨细胞系转化[12]是骨组织工程中种子细胞的重要来源同时在临床治疗骨不连、骨缺损等方面具有巨大的应用潜能。1材料和方法1.1材料淋巴细胞分离液、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶（Gibco公司）、小牛血清、维生素C、地塞米松及兔抗人Ⅰ型胶原抗体（Sigma公司美国）、兔抗人Ⅲ型胶原抗体（博士德公司）、ABC免疫组化检测试剂盒、噻唑蓝、二甲基亚砜（Amersco公司）。1.2方法1.2.1人骨髓基质干细胞的培养及诱导分化为成骨细胞参照文献[3～5]无菌条件下以含5ml肝素钠生理盐水(100U/ml)的20ml注射器于骨不连患者（术前检查肝肾功能正常无代谢性骨病经患者同意）髂后上棘穿刺抽取骨髓组织5ml移入含5ml肝素钠盐水的螺口试管内混匀加入含10mlFicoll梯度液的离心管中进行梯度离心(3000r/min×20min)吸管吸取单核细胞部分(云雾状层)以DMEM洗涤两遍(1000r/min×5min)按1×105cells/ml细胞数接种于25ml培养瓶内加入5ml含100ml/L小牛血清的DMEM在37℃、5%CO2培养箱中培养24h换液清除悬浮细胞而后隔日换液观察细胞生长情况。细胞长满培养瓶底80%后去培养液加0.25%胰蛋白酶1ml轻轻晃动培养皿使胰蛋白酶覆盖整个皿底37℃消化3～5min镜下见细胞皱缩间距加大分离为单个小圆细胞时滴加DMEM培养液中止消化然后吹打呈细胞悬液将细胞悬液移入15ml离心管离心10min1000r/min弃上清沉淀细胞加含血清DMEM培养液5ml吹打呈细胞悬液移入培养瓶在37℃、5%CO2培养箱中培养传代培养。传代改用含地塞米松和维生素C的诱导培养基进行细胞培养和扩增诱导培养基组成：含100ml/L胎牛血清的DMEM高糖培养基加入地塞米松和维生素C终末浓度分别为10mol/L和50ng/L。1.2.2人骨髓成骨细胞的鉴定1.2.2.1倒置显微镜观察观察细胞的形态结构、生长速度。1.2.2.2细胞碱性磷酸酶(ALP)化学染色第3代培养细胞长满后胰酶消化制成浓度为1×105cells/ml的细胞悬液接种于事先放入盖玻片的24孔板内加入定量含100ml/L小牛血清的DMEM培养液培养3d后取出4℃生理盐水冲洗置于冷丙酮中固定15min而后用钙钴法染色测定细胞ALP活性计算阳性细胞百分比。1.2.2.3Ⅰ型及Ⅲ型胶原抗体免疫组化染色将1×105cells/ml的成骨细胞和成纤维细胞悬液接种于24孔板内的盖玻片上培养3d后取出40g/L多聚甲醛4℃下固定15min乙醇脱水后吹干以兔抗人Ⅰ型及Ⅲ型胶原抗体为一抗按标准ABC检测试剂盒说明进行免疫组织化学染色。阳性为黄褐色。1.2.3细胞增殖检测（MTT比色试验）以0.25％胰蛋白酶消化培养瓶中的第三代贴壁细胞2～3min去胰蛋白酶加含血清DMEM终止消化把所得细胞悬液配成浓度为1×104cells/ml。取5块96孔板每块板5孔各加入细胞悬液200μl在37℃、5％CO2培养箱中培养4h。空白对照孔以200μlDMEM代替细胞悬液。细胞接种后24h为零点接种后1、2、4、6、8d用MTT比色试验[6]测细胞在支架上的增殖：每次各孔加5mg/L的MTT20μl37℃培养箱中培养4h去孔内液加0.25％胰蛋白酶消化