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高效液相色谱法前言:我国:课时安排: 第一章:高效液相色谱的基本原理4学时 第二章:高效液相色谱的仪器装置2学时 第三章:液固、键合相色谱3学时 第四章:离子交换色谱和离子对色谱3学时 第五章:凝胶渗透色谱1学时 第六章:实验技术和辅助实验技术1学时 复习1学时 参考书籍:§1-1概述一、色谱法液相色谱仪二、色谱法原理分离原理:三、高效液相色谱法的特点高速: 分析时间较经典液相色谱少得多(交换速度快),一个复杂样品的分析仅需几分钟到几十分钟。高灵敏度 ①紫外检测器的最小检测量可达(10-9g); 荧光检测器的灵敏度可达(10-11g)。 ②所需试样很少;微升数量级 高选择性 可分离不同类型化合物和异构体,也可分析在性质上极为相似的化合物 (同位素、同分异构体、空间异构体、手性化合物)高效液相色谱法的特性:四、HPLC与GC区别2.流动相的区别 GC:流动相为惰性,组分与流动相无相互作用 力,只与固定相有相互作用。 HPLC:流动相为液体,流动相与组分间有相互作用 力,参与和影响色谱分离. 对分离起主要作用。 3.操作条件差别 GC:加温操作 HPLC:室温;高压 说明:气相、液相地位同样重要 两种互补不足的色谱方法 灵敏度:气相﹥液相应用范围:液相﹥气相五、色谱法的分类§1-2基本概念 一、色谱图色谱过程特点:二、色谱参数2.分配系数K分配系数K的讨论3.容量因子k’(capacityfactor)4.容量因子与保留时间的关系5.选择性系数α色谱理论需要解决的问题?§1-3色谱柱的分离效率理论塔板高度H说明:塔板理论的特点和不足:(3)塔板理论无法解释同一色谱柱在 不同的流动相流速下柱效不同的 实验结果,也无法指出影响柱效 的因素及提高柱效的途径。二.峰扩展和速率方程式2.速率方程式(范·弟姆特方程式)A─涡流扩散项B/u—分子扩散项C·u—传质项固定相传质原因: 进出固定相速度不同(固相,液相) 减小措施:①使用薄的固定相层 ②小颗粒填料 移动相传质原因:迁移滞留 减小措施①填装均匀紧密 ②使用小颗粒填料和表面 多孔性填料 .3.速率理论的要点:(3)为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和填料对柱效及分离的影响。 选择最佳条件,才能使柱效达到最高。 4.获得高柱效的几种方法:5.影响分离的因素与提高柱效的途径 液体的扩散系数仅为气体的万分之一,在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小,可忽略不计,即H=A+Cu§1-4分离度(Rs)讨论:一.分离度的数学表达式:对浓度不同组分而言:二.分离度影响因素 ①峰的宽度(峰宽越小,Rs越大) 峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学特性 ②两峰的保留时间之差(△tR越大,Rs越大) 反映了色谱分离的热力学特性 分离度基本 关系式: 四.控制分离度方法例:流动相极性变化对组分k’的影响②更换色谱柱(改变N)③改变选择性系数五.分离度控制的一般原则:第二章仪器装置 四大部件: 高压输液泵 进样器 高效分离柱 检测器 §2-1高压输液泵 作用:向色谱柱输送一个连续、恒定的移动相。 一、对泵系统的要求 1.使用方便(易调节流量、过压保护等) 2.更换洗脱液容易、死体积小 3.有最大工作压力(20MPa,130MPa) 4.一定流量范围(直径小,流量小;速度快,流 量大。)(0.1~10ml/min) 5.流量稳定性好(流量噪声、流量波动、流量漂 移) 6.流量精度高机械往复式柱塞泵的工作原理:特点:梯度淋洗装置泵系统发展趋势§2-2色谱柱柱体为直形不锈钢管,内径1~6mm,柱长5~40cm。减小填料粒度和柱径以提高柱效。柱效的影响因素§2-3进样装置§2-4检测系统 功能:连续地将色谱柱中流出的组分随时间 变化的情况,转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中,得到色谱图。 按检测方式不同,分为: ①总体性质检测器(通用型) 示差折射检测器 ②溶质性质检测器(选择型) 紫外检测器、荧光检测器、电导检测器检测器的性能指标 一个理想检测器,必须具备下列条件: ①灵敏度高 ②不受温度及流动相流速变化的影响 ③响应随组分量的变化而线性地变化 ④稳定性好,操作方便 衡量指标: ①灵敏度S=△R/△Q ②噪音-在没有样品情况下,检测器输出的最大 振幅(温度、流量、泵) ③漂移-检测器在一段时间内,基线随时间的增 加而产生的偏离(电压、流动相) ④最小检测限-样品产生两倍于噪音信号时的 (检测下限)浓度 ⑤线性范围-检测信号呈线性变化时,最大和最 小进样量之比检测器a.紫外检测器 应用最广,对大部分有机化合物有响应。 特点:b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器三维:光谱-色谱图第三章液固色谱和键合相色谱存在竞争吸附:吸附-解吸平衡 ①溶质、流动相分子之间 ②溶质中不同官能