高效液相色谱法ppt课件.ppt

第十五章高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种液相色谱法。HPLC与经典LC区别HPLC与GC差别流动相差别
GC：流动相为惰性气体
组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用
HPLC：流动相为液体
流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素
流动相种类较多，选择余地广
流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相
可以增大分离选择性操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）.第一节液相色谱柱效速率理论（与GC对比）2.2）涡流扩散项及其影响.3）传质阻力项及其影响第二节高效液相色谱仪......2．进样系统.3、分离系统——色谱柱柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。4．检测系统...光电二极管阵列检测器
（2）总体检测器
对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。5、附属系统
包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。
它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。梯度淋洗装置第三节分配色谱（PartitionChromatography）在液液分配色谱中，一个液相作为流动相，另一个液相则涂在惰性担体上作为固定相。两者之间互不相溶，有一个明显的分界面。试样溶于流动相后，在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中，由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配，很快达到分配平衡。这种分配平衡的总结果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。由于固定液在流动相中有微量溶解，固定液会不断流失而导致保留行为发生变化，柱效和分离选择性变坏。因此，化学键合固定相逐渐代替涂渍固定相。一、化学键合相色谱法（CBPC）1、键合固定相类型
用来制备键合固定相的载体几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si—OH)与有机分子之间成键,即可得到各种性能的固定相。
（1）疏水基团：如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等；
（2）极性基团：如氨丙基、氰乙基、醚和醇等；

（3）离子交换基团：如作为阴离子交换基团的胺基、季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。.2、硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相3、正相色谱（NormalPhaseLiquidChromatography）
流动相的极性小于固定相的极性。常用于分离极性较强的化合物，组分与极性固定相的作用力主要是静电力，溶剂极性越强，洗脱能力也越强；溶剂极性越弱，洗脱能力也越弱。
分离顺序是极性较低的组分保留值小，先流出色谱柱。
常用饱和烃作流动相，加入适量极性溶剂以调节溶剂的强度，如甲醇、异丙醇等。4、反相键合相色谱法（ReversePhaseLiquidChromatography）在反相色谱中，通常以水为流动相的主体，再加入不同配比的有机溶剂作调节剂。
常用的流动相是甲醇/水、乙腈/水、四氢呋喃/水，粘度小，没有紫外吸收，而且能与水或缓冲溶液混合。关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。.反相色谱中，溶质的分离以溶质的疏水结构的差异为基础，溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。引入取代基增强溶质的疏水特性，能提高保留值，并与取代基的数目有关。
如果分子中增加极性基团，会使保留减小。根据溶质分子中非极性骨架的差别，或官能团的性质、