细胞培养技术制药ppt课件.ppt

第六章细胞培养技术制药动物细胞培养
动物细胞融合
单克隆抗体
胚胎移植
核移植获得细胞INVITRO:（离体的，即在玻璃容器中）用培养细
胞进行的实验
INVIVO:（在体内的）完整机体内进行的实验

生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫INVITRO，在活细胞内发生的生化反应叫INVIVO
体外细胞培养技术
细胞培养（cellculture）：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。

优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变。第一节哺乳动物细胞培养

第二节植物细胞培养

第三节昆虫细胞培养3、发展历史4、生长特性5、体外培养细胞基本技术5.1体外培养特点Animalcellsaremoredifficulttoculturethanmicroorganismsbecausetheyrequiremanymorenutrientsandtypicallygrowonlywhenattachedtospeciallycoatedsurfaces.Despitethesedifficulties,varioustypesofanimalcells,includingbothundifferentiatedanddifferentiatedones,canbeculturedsuccessfully.Pipets移液管Tubes锥形离心管和圆底试管CellCultureware细胞培养用品细胞培养瓶
表面处理（组织培养表面）
瓶盖的设计（酚盖、螺旋塞、透气型）
瓶颈（直颈、斜颈）
生长面积(12.5cm2-300cm2)CellCultureware细胞培养用品5.3体外培养条件培养条件RichMediaAreRequiredforCultureofAnimalCellsMostCulturedAnimalCellsGrowOnlyonSpecialSolidSurfaces5.4体外细胞生长增殖过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官应用原代培养（primaryculture）动物细胞原代培养过程图（1）动物处死：将出生2～3d乳鼠，用拉颈椎方法处死。背部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球擦拭腰部两侧被毛。
（2）取肾及剪肾：在无菌条件下将肾脏取出，置于无菌培养皿中，剪去肾膜和脂肪，用Hanks液洗涤1次；放入另一培养皿中，纵向剪开肾脏，去掉肾盂，将肾剪成1mm3大小的块，再并用Hanks液洗涤2～3次，直到液体澄清。（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌青霉素瓶内，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出青霉素瓶，在超净台中吸去胰蛋白酶液，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。（4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30～50万个细胞为宜。
（5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，在培养瓶上做好标记，置于37℃的CO2培养箱中培养。
（6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。
传代细胞培养（secondaryculture）（一）贴壁细胞传代培养
（1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。
（2）加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。
（3）用Hanks液洗涤1次，加入1～2滴管培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。
（4）以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。
（5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。（二）悬液细胞的传代培养
（1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。
（2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000r/min）5min。
（3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。
（4）以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。
（5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。5.5培养方法5.6大规模培养技术6、动物细胞培养技术的应用Vero细胞和