流式细胞术基本原理ppt课件.pptx

流式细胞术---原理、操作及应用教学参考书主要内容1.1流式细胞术简介流式细胞术的特点流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；
WB：群体分析，得到多个细胞的平均值。

流式细胞仪的发展及商品化1979年国家科委重点项目：
研制国内第一台激光流式细胞仪；
1982年国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生；
1984年国家科委组织科研成果的鉴定验收；
1985年获国家卫生部科技成果乙等奖；
1985年--1990年灵敏度、信噪比、更多参数；
流式分选仪研制开发；
计算机四参数软件；
样品制备、医学生物学应用。
流式细胞仪的分类BD公司分析型流式细胞仪BD公司分选型流式细胞仪BeckmanCoulter流式细胞仪1.2流式细胞仪的结构组成1.2.1液流系统（一）流动室和液流驱动系统（二）进样速率控制1.2.2光学系统（二）光束成行系统FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。（三）光收集系统FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统全反射光路1.2.3电子系统（一）光电检测器(photodetector)（二）电信号两种放大方式（三）电脉冲信号的面积A、高度H和宽度W光信号电信号数字信号通道(channel)
一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：
散射光通道:FSC通道和SSC通道；
荧光通道
通道命名方式：
以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。
以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。
Forexample：FACSCalibur有488nm和633nm两根激光器，488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能检测FL4(APC)，代表Calibur有6个通道，最多能同时检测4个荧光，6种参数。1.3流式细胞术光信号检测1.3.1散射光信号（二）侧向散射光SSC（三）散射光的作用（三）阈值Threshold1.3.2荧光信号（二）常用荧光素核酸荧光染料
PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。
Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。其他常用荧光染料（三）荧光抗体的选择（三）荧光抗体的选择B根据抗原表达强弱合理选择抗体
不同的荧光素强度有所不同；
高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：
CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE

1.4FCM数据存储、显示与分析FCM数据显示方式直方图Histogram横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。散点图散点图和伪彩图等高图和密度图假三维图和三维图设门与数据分析矩形十字门1.5流式分选四路分选原理液滴延迟分选指标分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。
分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。
分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。
富集模式(enrichmode)
纯化模式(purifymode)
单细胞模式(singlecellmode)流式分选和磁珠分选比较项目二、流式细胞术操作与技巧2.1单细胞悬液制备酶消化法：根据分散组织类型来确定使用的酶类：

胰蛋白酶—水解酯键、肽键；
胶原酶—降解几种分子类型的胶原；
溶菌酶—水解糖蛋白、肽的糖苷键；
弹性蛋白酶—消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。

将新鲜组织置于离心管中，加入1-2ml酶消化20-30min（恒温37℃或室温），间断振荡或吹打；
终止消化，收集细胞悬液，300目尼龙网过滤，除去细胞团块，低速离心除去细胞碎片；
将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。
注意：酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的pH值。机械法特点：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，