层析分离纯化技术.ppt

层析分离纯化技术内容提要生命科学与生物技术层析原理与操作层析的起源和原理什么是生物层析层析技术液相层析层析的5个操作步骤层析图DuoFLow非常直观，易学
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–TRACECOMPARE层析图比较DuoFLowDuoFLow纯化平台的硬件结构——层析介质与层析柱，原理与技术层析介质层析柱层析介质结构原理层析介质及其技术凝胶过滤层析1001,00010,000100,000
Bio-GelP2
Bio-GelP4
Bio-GelP6
Bio-GelP10
Bio-GelP30
Bio-GelP60
Bio-GelP100柱长的选择
分离：80－120cm
脱盐：30cm以下

洗脱液

离子强度1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质
具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30

2.脱盐cationpIProducts:
UNOsphere™Q&S,
Macro-Prep®HighQ&S,CM,DEAE,AG®resins
离子强度
洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.
在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。pI＝5.5Columns Media
Bio-ScaleQ Macro-PrephighQ
Bio-ScaleDEAE Macro-PrepDEAE
Bio-ScaleS Macro-PrephighS
Bio-ScaleCM Macro-PrepCM
Macro-Prep25Q
Macro-Prep25DEAE
Macro-Prep25S
UNOQ UNOsphereQ
UNOS UNOsphereS更高的选择性和分辨率
10%穿透载量:
UnosphereQ:>150mg/mlBSA@600cm/hr
UnosphereS:>30mg/mlBIgG@600cm/hr
高流速，低反压
－操作压力:<2bar@1200cm/hrwith20cm
更高的碱稳定性
短期:1.0MNaOH@RTfor>1week
长期:Storagein0.1MNaOH@RTfor>1year
生产效率大大提高
CaCa10(PO4)6(OH)2
5个带正电荷的Ca离子对（C位点）
2个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点）
2个羟基
于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面羟基磷灰石（CHT）蛋白质带正电氨基
经典的阳离子交换
用中性盐溶液(NaCl)或缓冲盐溶液(PO4)洗脱带负电羧基
经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节
比离子间静电相互作用强15–60倍
在无PO4条件下不能被任何浓度NaCl洗脱
用PO4洗脱大部分大分子蛋白质以两种保留机制联合模式结合：Ca亲和与阳离子交换
酸性蛋白质的结合，如白蛋白（albumin）以钙亲和作用为主，阳离子交换仅有轻微的作用，这意味着NaCl对白蛋白载量和保留的影响是非常有限的。
碱性蛋白质，如IgG以阳离子交换作用为主，其载量和保留受NaCl影响显著TypeI
由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.

TypeII
由于具有大孔结构，II型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA
白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.
大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备分离纯化原理与操作参数选择不同类型CHT陶瓷羟基磷灰石在不同pH下不同蛋白质的保留时间（min）基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术
疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合
不同离子的疏水性
Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-
Cations:M