酵母双杂交实验流程.doc

模块七蛋白质之间的相互作用1.实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。2.实验原理1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与）提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台近几年得到了广泛的运用和发展。相比于其它蛋白质筛选系统酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后在细胞内重建转录因子的作用而给出的省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时酵母表型、X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段由于仅仅采用-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域能与其他蛋白形成稳定的复合物从而引起报告基因的表达产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TATA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力这时选择性地使用HIS3报告基因一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶可以作用于相应的底物X--Gal和X--Gal使酵母变蓝。其中-半乳糖苷酶是外分泌酶在酵母表面就能直接检测到；-半乳糖苷酶是内分泌酶需要将酵母破碎后才能检测到。用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白的相互作用的方法不仅具有较高的敏感性而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋白相互作用的强弱。随着酵母双杂交系统的广泛应用这一系统得到了不断的完善及改进除了经典的双杂交系统以外同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系统、hSos/Ras募集系统（hSos/Rasrecruitmentsystems）、泛素分裂系统（Split-ubiquitinsystems）、双诱饵系统（Dual-baitsystems）等一系列相关系统根据这些系统的不同特点可以分别应用于蛋白质与DNA、RNA的相互作用、蛋白质复合体之间的相互作用、膜蛋白质之间的相互作用、筛选阻断蛋白间相互作用的药物等一系列领域对经典的酵母双杂交系统起到了很好的补充并有力地推动了酵母双杂交系统的发展与应用。酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成其中有DNA结合结构域（DNAbindingdomainDB）和转录激活结构域（activationdomainAD）它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。根据转录因子的这一特性将BD与已知的诱饵蛋白质X融合构建出BD-X质粒载体；将AD基因与cDNA文库基因片段或