基因组DNA的提取及电泳鉴定ppt课件.ppt

分子生物学实验实验课考试一、加样器的使用及注意事项
1、用途
2、如何使用？练习：加样器读数为100，实际体积各为多少?2.3加样器使用步骤(示教及学生练习)：

1）选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安装要紧密。
不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下。
2）吸取液体前，先打到第一挡。
3）将吸头插入液面下适当深度，
过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。
4）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒钟,急于离开液面，容易吸入空气。
5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去
6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！),贴容器内壁，将液体匀速打出，加样器推到第二挡。
观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内.1、打开电源
2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。4）加0.4ml生理盐水，悬浮细胞。
5）9000rpm,离心3分钟(统一离心)，弃上清，弹匀。乙醇沉淀1、STMT溶液：四种成份的英文缩写
S:Sugar8%
T:TritonX-1001%
M:MgCl20.5mM
T:Tris-HCl10mM(PH:8.0)

作用：
用Triton细胞膜上打孔，裂解细胞。
从末梢血中提取DNA主要是从白细胞中提取。
（而红细胞经过溶血处理后都已经裂解）。作用：a.阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分
b.使蛋白质变性
c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用重蒸酚:酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。
无色
酚的氧化产物(如醌等,粉红色)破坏磷酸二脂键。
重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。

TE溶液:Tris-HCl10mM(pH:8.0)
EDTA.Na21mM(pH:8.0)
作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。
在酸性条件下，DNA分配于有机相。
8-羟基喹啉：0.1%
黄色酚相指示剂
抗氧化剂氯仿作用：
a.氯仿的变性作用不如酚好，
但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果；
b.氯仿有加速有机相和水相的分离、
去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；课间休息1、加入550ul(等体积)TE饱和酚,混匀1min.10,000rpm,2min。
(注意抽取下层酚相;酚可腐蚀加样器等,加样器头用过即弃掉)
(轻柔混匀，避免DNA链断裂;但是太轻又起不到变性蛋白的作用)

2、将上层水相移至一新管中(要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。
加入500ul(等体积)酚/氯仿(已经配好，体积比1:1),
同上条件混匀、离心。

3、将上层水相移至一新管中。
加入500ul(等体积)氯仿-异戊醇，同上条件离心、取上清。

4、加入1/10体积（约30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。
加入2-2.5倍体积无水乙醇（约1ml）（通常加满小离心管），
混匀后交给老师，（统一置）-20℃1h(或-70℃10min)。注意事项：
1）本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清；
2）在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂尤其不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。
3）基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作，如用加样器反复吹打等，有时需要将加样器头尖剪断，以防由于太细造成基因组DNA通过狭小通道而断裂。注意事项：双蒸水溶解沉淀要充分。9、基因组DNA的酶切：

基因组DNA8ul
10xBufferH1ul
EcoRI(最后加入)0.6ul

置37℃保温45min。课间介绍（2）：1.酶切相关知识1.Southernblot
DNA水平基因结构分析的重要策略之一.
基因组DNA酶切电泳后可以直接用于Southernblot转膜。
2.构建基因组文库
3.PCR的模板
克隆表达基因
分析基因一级结构的变化
基因组PCR产物的酶切电泳可以分析基因多态性；
利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。DNA琼脂糖凝胶电泳实验第四部分、
DNA质量检测－－－琼脂糖电泳二、常用试剂1%琼脂糖凝胶电泳。

在样品中加2～3ul6×上样液，混匀，
加入上样孔内．

电泳条件：100～110伏，30-40分钟。

电泳结束后照像保存，结果分析。线性DNA片断大小（kb）琼脂糖浓度（%）
5–600.4
0.8–100.7
0.4–61.0
0.2–41.5
0.2–31.75
0.1–32.0五、电泳仪的使用方法用内切酶酶切基因组，电泳结果可出现连续的、弥漫云雾状带，称Smear带。
识别6bp序列的内切酶，平均每4096bp长度出现一次切割概率。123