-PCR基因扩增及扩增产物的回收ppt课件.ppt

Q&APCR基因扩增及其产物回收主要内容目的产物
目的基因AKP的扩增－PCRPCR（PolymeraseChainReaction）在体外特异性地扩增某个基因。DNA模板高温变性:双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。TGCATGCATDNA链的延伸：DNA聚合酶按碱基互补配对原则在模板上延伸DNA链。理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNAPCR的特点PCR反应的影响因素1.TaqDNA聚合酶无3’5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA2.引物设计的总原则：扩增的效率和特异性5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力两个引物间不能有两个以上连续碱基互补序列Tm=（G+C)4+(A+T)2Tm=81.5+16.6(lg[K+])+0.41(%[G+C])-675/n模板的量：不能太多，100l反应体系中约100ngdNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称，一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L，浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率PCR反应的条件优化关于本次实验大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因序列（CDS，1.5Kb）

551aagttgtcacggccgagacttatagtcgctttgtttttattttttaatgt
601atttgtacatggagaaaataaagtgaaacaaagcactattgcactggcac
651tcttaccgttactgtttacccctgtgacaaaagcccggacaccagaaatg
701cctgttctggaaaaccgggctgctcagggcgatattactgcacccggcgg
751tgctcgccgtttaacgggtgatcagactgccgctctgcgtgattctctta
801gcgataaacctgcaaaaaatattattttgctgattggcgatgggatgggg
851gactcggaaattactgccgcacgtaattatgccgaaggtgcgggcggctt
901ttttaaaggtatagatgccttaccgcttaccgggcaatacactcactatg
951cgctgaataaaaaaaccggcaaaccggactacgtcaccgactcggctgca
1001tcagcaaccgcctggtcaaccggtgtcaaaacctataacggcgcgctggg
1051cgtcgatattcacgaaaaagatcacccaacgattctggaaatggcaaaag
1101ccgcaggtctggcgaccggtaacgtttctaccgcagagttgcaggatgcc
1151acgcccgctgcgctggtggcacatgtgacctcgcgcaaatgctacggtcc1201gagcgcgaccagtgaaaaatgtccgggtaacgctctggaaaaaggcggaa
1251aaggatcgattaccgaacagctgcttaacgctcgtgccgacgttacgctt
1301ggcggcggcgcaaaaacctttgctgaaacggcaaccgctggtgaatggca
1351gggaaaaacgctgcgtgaacaggcacaggcgcgtggttatcagttggtga
1401gcgatgctgcctcactgaattcggtgacggaagcgaatcagcaaaaaccc
1451ctgcttggcctgtttgctgacggcaatatgccagtgcgctggctaggacc
1501gaaagcaacgtaccatggcaatatcgataagcccgcagtcacctgtacgc
1551caaatccgcaacgtaatgacagtgtaccaaccctggcgcagatgaccgac
1601aaagccattgaattgttgagtaaaaatgagaaaggctttttcctgcaagt
1651tgaaggtgcgtcaatcgataaacaggatcatgctgcgaatccttgtgggc
1701aaattggcgagacggtcgatctcgatgaagccgtacaacgggcgctggaa
1751ttcgctaaaaaggagggtaacacgctggtcatagtcaccgctgatcacgc
1801ccacgccagccagattgttgcgccggataccaaagctccgggcctcacc