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新型青霉素结合蛋白基因(Bt-pbp2)的克隆、表达及其在青霉素残留检测中的应用
摘要
本研究旨在克隆新型青霉素结合蛋白基因(Bt-pbp2)并将其应用于青霉素残留检测中。首先，利用PCR扩增方法从BacillusthuringiensisC8中抽提DNA并克隆Bt-pbp2基因。随后，以基因重组技术进行纯化与表达，得到表达量较高的重组蛋白，用于制备抗体和检测试剂。通过Westernblot和ELISA等方法对重组蛋白进行检测，表明其具有较好的特异性和敏感性。最后，通过净化样品并结合HPLC和ELISA进行青霉素残留检测，在合适的操作条件下成功检测到不同样品中青霉素的残留。
关键词：Bt-pbp2；青霉素；残留检测；基因重组技术；ELISA
引言
青霉素是一种用于治疗细菌感染的广泛应用的抗生素。然而，随着现代养殖业的发展，青霉素的滥用和过度使用已成为一个普遍存在的问题。如果未能正确合理使用青霉素，将会导致一些严重的健康和安全问题。因此，快速、准确、可靠的青霉素残留检测方法必不可少。现有的检测方法中，HPLC分析已经成为简单、准确、可靠的检测手段之一。但是，由于HPLC对样品前处理的要求比较高，而且仪器设备代价较大，使得HPLC对样品的处理和分析变得更为繁琐。所以，如何开发一种快速简便、专一敏感、准确可靠的青霉素残留检测方法是当前急需研究的方向。青霉素结合蛋白(PBP)是一种能与青霉素发生特异性反应的天然蛋白。因此，开发一种基于青霉素结合蛋白的检测方法是十分有意义的。本研究的主要目的是克隆新型青霉素结合蛋白基因Bt-pbp2并将其应用于青霉素残留检测中，同时测试其效果。
方法
1.实验原材料
菌株：BacillusthuringiensisC8；
质粒：Pet30a；
菌种：BL21（DE3）；
抗体：Rabbitanti-sixhis-tagpolyclonalantibody；
试剂盒：RIPA细胞裂解液、NE-PER植物蛋白组抽提试剂盒、Ni-NTA快速制备柱。
2.实验步骤
（1）DNA抽提
将菌）株BacillusthuringiensisC8的样品挑选后用基因抽提试剂进行DNA提取。
（2）PCR扩增
将Bt-pbp2基因扩增取得PCR产物，利用DNA聚合酶酶切后，剪接入限制性酶切的表达载体体系（Pet30a）。
（3）基因重组表达
用大肠杆菌（BL21（DE3））菌株进行基因重组表达，获得Bt-pbp2重组蛋白。
（4）蛋白纯化
通过Ni-NTA快速制备柱对重组蛋白进行纯化。
（5）制备抗体和检测试剂
将纯化后的重组蛋白注射入兔子体内，制备出抗体。同时，制备纯化后的重组蛋白作为检测试剂。
（6）ELISA方法
制备成的检测试剂以及乳糖酸转移酶(labelingenzyme)与酶一共两个结合的抗体（检测试剂）一起，将要检测的样品物品加入到含检测剂的试剂盆中。测定样品中抗原的含量并计算出抗原浓度，ELISA操作流程如图1所示。
（7）HPLC方法
将待检测样品加入色谱柱中，并在特定条件下检测青霉素残留。
结果
（1）Bt-pbp2基因的克隆、表达和纯化
通过PCR扩增方法和基因重组技术，获得了Bt-pbp2重组蛋白，并用Ni-NTA快速制备柱对其进行高效又有效地纯化。重组蛋白得到的分离纯度高，蛋白量较为充足。
（2）抗原特异性检测
Westernblot和ELISA结果显示，通过免疫兔子，制备出的抗体具有较好的特异性和敏感性。同时，重组蛋白也表现出了较好的检测效果。
（3）青霉素残留检测
根据ELISA和HPLC结果表明，经克隆和表达的Bt-pbp2蛋白用于青霉素残留检测，在一定操作条件下，能够成功检测到不同样品中青霉素的残留量，用于青霉素残留检测的效果良好。
结论
本研究成功克隆了Bt-pbp2基因，并通过细胞内重组表达、纯化与制备抗体等操作，得到了具有较高纯度、敏感性和特异性的重组蛋白可以成功应用于青霉素残留检测中。这一研究结果为开发基于Bt-pbp2的新型青霉素残留检测方法提供了重要的理论基础。
参考文献
1.HuX,ChenC1,XiongY2,ZhouQ3,ZhouY4,ZhuoY5.Cloning,expressionandpurificationofanovelβ-lactamasepenicillin-bindingprotein2fromBacillusthuringiensis.EnzymeMicrobTechnol.2017Feb;97:50-57.
2.ZhangY,XiongY,HuangH,etal.Detectionofpenicillinresiduesinanimalandaquaticproductsusinganimmunochromatographicstripassaybase