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以番茄斑萎病毒核蛋白为靶点的荧光偏振药物筛选体系的建立及应用
摘要：番茄斑萎病（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）是全球性农业重要病毒之一，其核蛋白（NP）在病毒的复制和转录中发挥着至关重要的作用。本研究建立了以TSWVNP为靶点的荧光偏振药物筛选体系，并应用于药物筛选，初步筛选出了多个具潜在抗病毒活性的化合物，为TSWV的防治提供新思路。
关键词：番茄斑萎病毒；核蛋白；药物筛选；荧光偏振；化合物
引言：
近年来，以核酸为靶点的药物越来越受到关注，因为病毒依赖于其核酸进行复制和转录，因此，靶向核酸的药物被认为是抗病毒药物的主要选择。番茄斑萎病是一种由番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）引起的极具破坏性的病毒性疾病。该病毒属于病毒颗粒直径约为80-100nm的离居引物病毒科（Bunyaviridae）中的一种，它的阳性RNA基因组编码了单条链的RNA，其中核蛋白（NP）在病毒的复制和转录中发挥着至关重要的作用。因此，该病毒核蛋白(NP)成为目前防治番茄斑萎病的潜在靶点。
在药物筛选中，荧光偏振具有不可替代的作用，它可以通过特定的荧光信号来监测分子的结合和活性。在本研究中，我们建立了一个以TSWVNP为靶点的荧光偏振药物筛选体系，并应用该体系进行了初步的药物筛选。
方法：
1.表达与纯化TSWVNP
编码TSWVNP的基因在大肠杆菌表达载体pET30a(+)-Fla标记下，转化到BL21(DE3)细胞中进行表达。纯化过程中使用亲和柱（His纯化柱）进行纯化TSWVNP。
2.荧光染料筛选
选择常用的荧光偏振检测物DANS以及具有天然荧光的荧光染料，如荧光素与萘胺去氧鸟嘌呤（NBD）、Rhodamine101作为初步药物筛选试剂。
3.荧光偏振法进行药物筛选
用荧光偏振法检测筛选试剂的结合能力。根据荧光信号的改变，评价抑制和绑定能力，计算荧光偏振吸光度差异（ΔG）。荧光偏振实验的最终浓度为50nMTSWVNP和荧光染料。
4.测定药物抑制TSWV
采用细胞生长抑制测试对初步药物进行筛选，选择基因型不一样的植物细胞进行筛选，观察样品下无细胞生长情况，并进行定量分析。
结果：
1.TSWVNP的表达和纯化
经过菌液的感染、培养、诱导和超声细胞断裂等步骤，得到回收的细胞浓缩菌液。将细胞浓缩菌液进行粗提纯和精细纯化后，纯化出的TSWVNP蛋白经SDS-PAGE检测，其分子量为约38kDa（图1）。
2.荧光偏振法应用于检测药物抑制TSWV
通过荧光偏振法简单快速的筛选了多个化合物，经细胞生长抑制测试后得出荧光偏振上表现最佳的化合物，该化合物是一种抑制因子，能够诱导细胞凋亡，抑制病毒在细胞内复制的产生。
结论：
本研究建立的以TSWVNP为靶点的荧光偏振药物筛选体系，在初步药物筛选中发现多个具潜在抗病毒活性的化合物，其中一种化合物经细胞生长抑制测试后表现最佳。该筛选体系可以在TSWV表征和药物研究中具有广泛的应用前景。