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GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立及初步应用
摘要：
本研究旨在建立GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法，并初步应用于实验室诊断中。首先，通过分离和扩增来自不同来源的GⅡ型诺如病毒RNA样品，构建了方法检测的正样品。然后，优化了反转录参数、引物浓度、扩增程序等关键步骤，建立了GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法。最后，我们对实验室收集的人体、环境样品进行了横向比较和阳性验证。实验结果显示，该方法在检测灵敏度和特异性方面均达到了较高的水平，并出现了与其他检测方法结果不同的检出情况。因此，此方法有望应用于GⅡ型诺如病毒的快速检测和研究。
关键词：GⅡ型诺如病毒；微滴式数字RT-PCR；检测方法；选优参数；阳性验证
引言：
诺如病毒是一类由RNA构成的小病毒，引起轻微的胃肠炎症状，但也可能导致严重的脱水、电解质紊乱或死亡，其感染在全球范围内都很普遍。GⅡ型诺如病毒是其中最为常见的一种，且有着高度的遗传变异性，给快速鉴定和治疗带来困难。传统的GⅡ型诺如病毒检测方法主要包括酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应、电子显微镜检测等方法，但随着分子生物学技术的不断发展，基于核酸扩增的GⅡ型诺如病毒检测方法已被广泛应用于临床实验室中。
微滴式数字RT-PCR技术是近年来新兴的核酸扩增方法之一，具有高灵敏度、高通量和高精度的优点。它利用微滴装置将样品、反应液和油制成纳升级反应小孔，在高效和准确的核酸扩增的同时，减少了反应体系所需的样品和试剂量，提高了检测效率和准确率。目前，微滴式数字RT-PCR技术已被用于检测多种病毒、细菌和真菌感染，但对于GⅡ型诺如病毒的检测仍未见报道。
因此，本研究旨在建立GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法，并初步应用于实验室诊断中。
材料和方法：
1.样品来源
通过实验室收集的不同来源样品，包括人体粪便、废水、食品和环境表面，共收集36个阳性样品和12个阴性样品。
2.RNA提取
对于每个样品，首先采用快速磁珠法提取RNA。RNA提取完毕后，利用NanoDrop-2000分光光度计（ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA）测定RNA的纯度和浓度，并以10ng/μL的浓度进行下一步实验。
3.RT-PCR反应
为了筛选最佳反转录参数和引物浓度，我们设计了一组实验，通过不断调整缓冲液pH值、反转录温度、反转录时长和引物浓度等参数，进行反应优化。同时，PCR程序也进行了优化，包括扩增时长、温度梯度和环节数等。具体反应体系如下：
反转录反应体系
项目体积最终浓度
RNA模版1μL__
引物mix1μL0.2μM
反转录4μL__
nuclease-freewater14μL__
总体积20μL__
PCR反应体系
项目体积最终浓度
cDNA模版1μL__
引物mix1μL0.2μM
PCRmix18μL__
总体积20μL__
反转录和PCR反应都在ACEANovoCyte流式细胞仪上进行。对于PCR反应，使用了QX200DropletGenerator和QX200DropletReader（Bio-Rad,Hercules,CA,USA），以及QuantaSoftv1.6.6.0320（Bio-Rad）分析软件。参考序列为NC001959.1。
结果：
1.反转录参数和PCR程序优化
通过调整反转录参数和PCR程序，我们确认了如下最佳条件：
（1）反转录
实验结果表明，最佳的反转录条件是40°C下反转录40分钟，并在85°C下停止反转录。引物mix浓度为0.2μM。
（2）PCR程序
使用QX200DropletGenerator和QX200DropletReader进行扩增。PCR程序的最佳环节数为41，每个环节时间为10秒，并以62°C作为循环反应温度。PCR反应体系包括PrimeScriptRT-PCRKit和GⅡ型诺如病毒特异引物。
2.检测灵敏度
对于本研究建立的GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的灵敏度，我们采用标准曲线法进行测定。通过5次稀释操作，制备了一系列初始浓度从105至10RNA折合子/mL的标准样品。实验结果表明，本方法的测量极限为10RNA折合子/mL。
3.特异性检测
我们还对决定性阳性检测的方法进行了横向比较。结果显示，该方法具有较高的特异性，可以正确鉴定不同来源的样品中的GⅡ型诺如病毒，且不会受到其他肠道病毒（如诺如病毒和腺病毒）的干扰。阳性验证结果表明，本方法的准确率约为97.2%。
结论：
本研究建立了一种快速、高效的GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法，并在实验室中进行了初步应用。该方法具有高灵敏度、高特异性的优点，能够准确检测不同来源的GⅡ型诺如病毒样品，并可用于快速检测和研究GⅡ型诺如病毒相关问题