牛诺如病毒和冠状病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用.pdf

牛诺如病毒和冠状病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用王文佳;师志海;兰亚莉;徐照学【期刊名称】《《动物医学进展》》【年(卷),期】2019(040)010【总页数】4页(P6-9)【关键词】牛诺如病毒;牛冠状病毒;犊牛腹泻;双重聚合酶链反应【作者】王文佳;师志海;兰亚莉;徐照学【作者单位】河南牧业经济学院制药工程学院河南郑州450046;河南省农业科学院畜牧兽医研究所河南郑州450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6牛诺如病毒(Bovinenorovirus，BNoV)是杯状病毒科、诺如病毒属的单股正链RNA病毒，能够引起犊牛腹泻，健康犊牛常呈隐性感染。该病毒首次在英国发现[1]，随后德国[2]、美国[3]、韩国[4]等地也相继报道。我国于2017年首次在腹泻犊牛的粪便中检测出该病毒[5]。NoV共有7个基因群(GⅠ～GVⅡ)，BNoV属于基因群GⅢ。BNoV又分为2个基因型，目前我国仅检测出基因1型[5]。牛感染NoV后常引起腹泻、厌食、消化不良、精神不振，腹泻持续3d～4d，3周龄的犊牛比新生犊牛发病严重，但BNoV的致病机制尚不清楚[6]。牛冠状病毒(Bovinecoronavirus，BCoV)是冠状病毒科、冠状病毒属的单股正链RNA病毒，是引起犊牛腹泻[7]、成年牛冬痢[8]和呼吸道疾病[9]的主要病原之一，健康犊牛为隐性带毒者[10]。犊牛感染多见于1日龄～9日龄，腹泻于7日龄～10日龄达到高峰，病犊厌食，精神沉郁，水样腹泻。该病发病率高、病死率低，引起奶牛产奶量下降，犊牛及成年牛体重减轻，给养牛业带来巨大损失。BCoV感染引起犊牛腹泻的作用机制目前尚不清楚，可能与感染犊牛肠道吸收不良和体液分泌过多有关。BNoV和BCoV感染均能引起犊牛发病，导致腹泻，且两者常混合感染，由于两者致病的临床症状和病理剖检变化较为相似，临床诊断容易造成误诊，给疾病的及时防控和治疗带来困难。本研究建立的BNoV和BCoV双重PCR检测方法能同时检测BNoV和BCoV，可为BNoV和BCoV的疫情监控及分子流行病学调查提供技术支撑。1材料与方法1.1材料1.1.1主要材料及临床病料收集牛冠状病毒(BCoV)、牛诺如病毒(BNoV)、牛星状病毒(Bovineastrovirus，BAstV)、牛轮状病毒(Bovinerotavirus，BRV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)、牛嵴病毒(Bovinekobuvirus，BKV)、牛纽布病毒(Bovinenebovirus，BNeV)阳性样品均由本实验室收集、鉴定保存；127份临床样本采集于河南地区的牛场。1.1.2主要试剂MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit、PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit、pMD18-T、大肠埃希菌DH5α感受态、PremixTaq、DNAMarker2000，TaKaRa公司产品；GelExtractionKit(D2500)、PlasmidMiniKit(D6943)，OMEGA公司产品。1.2方法1.2.1临床样品处理及病毒核酸提取127份临床样品，用PBS按1∶10(w∶V)混悬，漩涡振荡30s，4℃、8000r/min离心5min，收集上清，置-80℃保存备用。采用ViralRNA/DNAExtractionKit提取总RNA，并用1stStrandcDNASynthesisKit制备cDNA，置-20℃保存备用。1.2.2引物的设计及合成根据BNoVORF1基因(NC029645)和BCoVORF1ab基因(BCU00735)序列，利用Premier5.0软件分别设计特异性引物(表1)。引物由华大基因生物科技有限公司合成。表1双重PCR引物Table1PrimersofduplexPCR引物名称Primername引物序列(5′→3′)Sequence(5′→3′)片段长度/bpLengthBNoV-FGGCAAACCACGCAAACAAC542BNoV-RCTTCCGAAAGGGCACAGABCoV-FTAGTAGTTCAGAGGTGGAT896BCoV-RACAAGTCTTCAGTAGGGT1.2.3双重PCR扩增对双重PCR反应的引物、模板等用量进行优化和多次重复试验后确定最佳反应体系。将反应退火温度从45℃～57℃梯度递增，多次试验后确定最佳退火温度。最佳双重PCR反应体系为：PremixTaq10μL，上、下游引物各0.5μL(10pmol/μL)，cDNA模板1.0μL，ddH2O补足20μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃1min，54℃1