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达沙替尼联合AKT抑制剂对kasumi-1细胞增殖和凋亡的影响
摘要：
本研究旨在探究达沙替尼联合AKT抑制剂对Kasumi-1细胞增殖和凋亡的影响。通过细胞计数、流式细胞术、Westernblot和荧光显微镜等技术分析了细胞生长和凋亡相关分子表达的变化。研究结果表明，达沙替尼联合AKT抑制剂可以显著抑制Kasumi-1细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并且明显下调了细胞周期相关的蛋白CDK2、CDK4、cyclinD1和cyclinE等的表达，上调了凋亡相关蛋白Cleavedcaspase-3和Bax的表达。因此，本研究结果表明达沙替尼联合AKT抑制剂可作为治疗Kasumi-1细胞增殖的有效药物。
关键词：达沙替尼；AKT抑制剂；Kasumi-1；增殖；凋亡
引言：
Kasumi-1细胞是一种来源于急性髓性白血病（AML）患者的人骨髓白血病细胞系。AML是一种非常危险的血液系统恶性肿瘤，是成年人中最常见的急性白血病之一。化疗药物对AML患者的治疗效果不一，一些AML患者对化疗不敏感，因此需要寻找新的治疗手段。达沙替尼是一种多酪氨酸激酶（FLT3）抑制剂，已经被证明在治疗某些类型的AML患者中非常有效。然而，由于单独使用达沙替尼可能出现治疗耐药性和不良反应，因此联合其他药物可能会产生更好的治疗效果。AKT是一个重要的细胞信号传导分子，参与多种生命活动的调控，包括细胞增殖、凋亡等。因此，使用AKT抑制剂联合达沙替尼可能会产生协同作用，影响Kasumi-1细胞增殖和凋亡。本研究旨在探究达沙替尼联合AKT抑制剂对Kasumi-1细胞增殖和凋亡的影响，以期为AML的治疗提供新思路和方案。
材料与方法：
1.细胞系及培养条件
本研究选取Kasumi-1细胞，该细胞系由中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学研究所提供。Kasumi-1细胞在RPMI1640培养基中，加10%的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，在37℃、5%CO2的条件下培养。
2.药物处理
达沙替尼和AKT抑制剂MK2206均由SelleckChemicals供应。Kasumi-1细胞分为4组：对照组、达沙替尼组、MK2206组、达沙替尼联合MK2206组。达沙替尼的浓度为0、0.1、0.5和1μmol/L，MK2206的浓度为0、0.5、1和5μmol/L，细胞处理时间为24小时。
3.细胞计数
Kasumi-1细胞处理后，用Trypanblue染色计数存活细胞数。缓慢旋转离心沉淀细胞，去除上清中的胶体物质，并用PBS洗涤。使用0.4%的Trypanblue染色溶液染色，待10分钟后观察，活细胞不染色，死细胞染色。使用细胞计数仪统计活细胞数。
4.流式细胞术
细胞在4℃的PBS溶液中洗涤后，使用70%的乙醇固定，随后再用PBS洗涤。使用信号路径的“AnnexinV-FITC/PI”检测Kit检测Kasumi-1细胞的凋亡。将细胞分为4个组：对照组，达沙替尼组，MK2206组和达沙替尼联合MK2206组。
5.Westernblot
细胞经过不同处理后，收集细胞，加入RIPA（Radioimmunoprecipitationassay）细胞裂解液，含磷酸化抑制剂和蛋白酶抑制剂。离心后，取得上清液。使用BCA（bicinchoninicacid）检测蛋白质浓度。使用SDS-PAGE（聚丙烯膜凝胶电泳）技术分离蛋白质，将蛋白质转移至聚乙烯膜，随后使用Westernblot检测蛋白质，显示蛋白质的相对表达水平。
6.荧光显微镜
使用细胞防护用于培养Kasumi-1细胞，处理后进行转染。使用CellomicsArrayscanVTI流式细胞成像平台分析荧光染色细胞。
结果：
1.达沙替尼联合AKT抑制剂可以显著抑制Kasumi-1细胞的增殖。
达沙替尼和MK2206单独处理Kasumi-1细胞时，相对于对照组，可以减少细胞的增殖。而联合处理时，细胞的增殖受到更大程度的抑制（图1）。
2.达沙替尼联合AKT抑制剂可以诱导Kasumi-1细胞凋亡。
对比到对照组，只有单独使用达沙替尼或MK2206处理时，Kasumi-1细胞凋亡率也有所上升。而联合使用较高浓度的达沙替尼和MK2206处理时，可以显著促使细胞凋亡。这一现象在AnnexinV-FITC/PI染色实验中得到了证实（图2）。
3.达沙替尼联合AKT抑制剂可以调控Kasumi-1细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。
对Kasumi-1细胞进行Westernblot时，单独使用较高浓度的达沙替尼或MK2206对CDK2、CDK4、cyclinD1和cyclinE的表达均有所降低。而联合处理时，这些蛋白的表达更进一步下调。另一方面，达沙替尼联合MK2206处理Kasumi-1细胞可以显著上调Cleavedcaspase