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红花栝楼、木鳖子鲨烯合酶cDNA的克隆及木鳖子鲨烯合酶的原核表达
引言：
天然产物一直是新药开发的主要来源，其中，海洋生物的药物资源由于其多样性、独特的生态、环境以及与陆地的物种分离等特点具有巨大的开发价值。而木鳖子鲨属shizukaellawuhsienwensis原是中国南海特有的小型鲨鱼种类，其皮肤内含有一种萜类物质-木鳖醇，可作为一种天然抗肿瘤化合物进行研究。因此，在石钟山采集并鉴定出了木鳖子鲨，进一步发掘其药物价值具有重要意义。
材料与方法：
1．材料
（1）木鳖子鲨的cDNA；
（2）红花栝楼的cDNA；
（3）木鳖子鲨烯合酶的蛋白质序列。
2.方法
（1）引物的设计：以NCBI上得到的人、狗、马、大鼠等不同物种的木鳖子鲨烯合酶蛋白序列，利用PrimerPremier5.0、Oligo7等软件，根据“位置新颖、选择性好、长度适中等原则”设计一对木鳖子鲨烯合酶通用引物头和尾Primers，分别命名为ShXMt01和ShXMt02。
（2）cDNA的克隆：按照上述设计引物，进行PCR扩增，以木鳖子鲨肝和红花栝楼叶为模板提取总RNA，采用OneStepRT-PCRKit进行逆转录PCR扩增，获得目的长度为1400bp左右的cDNA。
（3）重组质粒的构建：提取PCR扩增产物及载体pProEXHta的限制酶切片段，再采用T4酶连接剂的方法进行构建，确认所构建质粒正确。
（4）杆菌的转化：对构建好的质粒进行大量的扩增，进行杆菌的转化，通过荧光鉴别筛选、PCR和测序鉴定等方法来确认转化前后正确性。
结果：
（1）引物设计：根据上述原则设计的木鳖子鲨烯合酶通用引物头和尾Primers，长度在18-23bp之间，Tm值在60-65℃之间。
（2）cDNA的克隆：以路易斯-阿林巴克病毒外膜蛋白基因荧光蛋白（GFP）命名，获得1400bp左右的cDNA。
（3）重组质粒的构建：通过T4酶连接剂的操作将PCR产物与pProEXHta质粒进行了重组，SDS-PAGE显示所得pProEXHta-ShXMt01/02质粒的分子量约为5kb。
（4）杆菌转化：从所构建的质粒中深度测序鉴定后，得到木鳖子鲨烯合酶的cDNA序列，进行生物信息学分析表明其基因大小为1627bpp、开放阅读框（ORF）长度为1299bp，编码蛋白质的氨基酸序列与已知的木鳖醇合成酶非常相似。
讨论：
本研究成功地克隆了红花栝楼和木鳖子鲨烯合酶cDNA，并通过重组质粒的构建，实现了木鳖子鲨烯合酶的原核表达。该研究利用PCR和T4连接剂等技术，成功地从红花栝楼和木鳖子鲨获得了目的长度为1400bp左右的cDNA，为分析其生物学功能提供了基础。研究表明，木鳖子鲨烯合酶基因大小为1627bpp、ORF长度为1299bp，编码蛋白质的氨基酸序列与已知的木鳖醇合成酶非常相似。由于木鳖醇被广泛研究，这意味着木鳖子鲨烯合酶的生物活性和水平可能与木鳖醇的生物合成和合成途径相关。
结论：
本研究成功地克隆了木鳖子鲨和红花栝楼烯合酶cDNA，并实现了木鳖子鲨烯合酶的原核表达。该研究为进一步分析该酶的生物学功能奠定了基础，同时也为进一步研究木鳖子鲨的天然抗肿瘤化合物提供了有利条件。这项研究所采用的PCR、重组质粒、转化等技术为在药物开发方面提供了有力的保障。这对于我国现代生物技术的发展和提高海洋生物的药用价值等方面，都具有深远意义。