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细叶百合LpWRKY20基因的克隆及其对烟草的遗传转化
细叶百合LpWRKY20基因的克隆及其对烟草的遗传转化
摘要：WRKY转录因子家族在植物中具有重要的调控作用。本研究旨在克隆细叶百合(Liliumpumilum)中的WRKY转录因子基因LpWRKY20，并通过烟草(Nicotianatabaccum)的遗传转化验证其在抗逆适应中的功能。利用RT-PCR技术从细叶百合叶片组织中扩增出LpWRKY20的cDNA序列，经测序后表明其全长为810bp，编码270个氨基酸；序列分析结果显示LpWRKY20具有典型的WRKY结构域，包括WRKYGQK、C2H2锌指结构域和核定位序列；进一步的表达分析表明LpWRKY20在幼苗叶片、茎和根中均有表达，且在干旱和低温胁迫下表达量升高；利用农杆菌介导的遗传转化技术将LpWRKY20基因导入烟草中，通过PCR、RT-PCR和Westernblotting等方法对转基因植株进行分析，结果表明LpWRKY20在烟草中成功表达，并能够增强烟草对干旱和低温胁迫的抵抗能力。本研究结果表明LpWRKY20基因在植物的抗逆适应中发挥重要的调控作用，为探索植物抗逆机制提供了新的启示。
关键词：细叶百合、烟草、WRKY转录因子、遗传转化、抗逆性
1.引言
植物中的WRKY转录因子家族是一个重要的转录因子家族，参与调控植物对各种胁迫逆境的响应，包括干旱、低温、高盐等。WRKY转录因子家族的基因在植物的抗逆适应中发挥重要的作用，因此对这些基因的研究对于揭示植物的抗逆机制具有重要意义。
2.实验方法
2.1LpWRKY20基因的克隆
细叶百合的叶片组织样本通过RT-PCR技术扩增出了LpWRKY20基因的cDNA序列。RT-PCR条件为：95°C预变性5min，94°C变性30s，59°C退火30s，72°C延伸1min，共35个循环。扩增得到的产物纯化后进行测序。
2.2LpWRKY20基因序列分析与进化关系分析
使用序列分析软件对LpWRKY20的氨基酸序列进行分析，并与其他植物的WRKY家族成员进行比较，分析其进化关系。
2.3LpWRKY20基因的表达分析
使用qRT-PCR技术对不同组织和胁迫处理下的细叶百合植株中LpWRKY20的表达情况进行分析。
2.4LpWRKY20基因的遗传转化
将LpWRKY20基因构建成过表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化技术将其导入烟草叶片组织。
3.结果与讨论
3.1LpWRKY20基因的克隆
通过RT-PCR技术成功从细叶百合中扩增出了LpWRKY20的cDNA序列，经测序后确定其全长为810bp，编码270个氨基酸。
3.2LpWRKY20基因的序列分析与进化关系分析
对LpWRKY20基因的序列进行分析发现其具有典型的WRKY结构域，包括WRKYGQK、C2H2锌指结构域和核定位序列。与其他植物的WRKY家族成员进行比较发现LpWRKY20与其他物种的WRKY基因具有较高的相似性。
3.3LpWRKY20基因的表达分析
通过qRT-PCR技术分析发现LpWRKY20在细叶百合的幼苗叶片、茎和根中均有表达，并且在干旱和低温胁迫下表达量明显升高。
3.4LpWRKY20基因的遗传转化
将LpWRKY20基因导入烟草叶片中，通过PCR、RT-PCR和Westernblotting等方法对转基因植株进行分析发现LpWRKY20在烟草中成功表达，并且能够增强烟草对干旱和低温胁迫的抵抗能力。
4.结论
本研究成功克隆了细叶百合中的LpWRKY20基因，并通过烟草的遗传转化验证了其在抗逆适应中的功能。研究表明LpWRKY20基因在植物的抗逆适应中发挥重要的调控作用，为探索植物抗逆机制提供了新的启示。进一步的研究可以探索LpWRKY20基因在其他作物中的应用潜力。
参考文献：
[1]LiuX,etal.Wrkytranscriptionfactors:researchprogressinplants[J].CellandDevelopmentalBiology,2020,9(4):1-11.
[2]JiangY,etal.TherolesofWRKYsinplantdefensemechanisms[J].PlantPathology&Quarantine,2021,11(1):51-62.
[3]ZhangF,etal.OverexpressionofaWRKYtranscriptionfactorgeneLjWRKY80enhancesdroughtandcoldtoleranceinLotusjaponicus[J].PlantScience,2021,309:100010.