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牡丹PsSVP基因的克隆与功能分析
摘要：
牡丹（PaeonialactifloraPallas）是中国传统的著名观赏园林植物，其花朵富丽堂皇、色彩斑斓、香气浓郁，深受人们喜爱。本研究利用PCR技术从牡丹中克隆到一个PsSVP基因，对其进行了生物信息学分析、功能预测以及实验验证，结果表明，PsSVP基因为一种抑制开花基因，研究结果为揭示牡丹开花调控机理提供了一定的参考价值。
关键词：牡丹；PsSVP基因；克隆；功能分析
1.引言
花卉作为园林特色植物，在景观美化和文化传承中发挥着重要作用，而牡丹作为中国园林的重要代表之一，其成熟期的花朵色彩丰富、花型优美，极富观赏性，巨大的观赏价值促使人们对其生物学特性进行了深入研究。目前，牡丹的开花调控机理仍然不完全明确，尤其是在分子水平上的研究相对较少。因此，本研究旨在通过克隆牡丹中的PsSVP基因并对其进行生物信息学和实验分析，以期为揭示牡丹开花调控机理提供参考。
2.材料和方法
2.1植物材料
本研究采用常规育苗方法从牡丹品种“水仙”中选取健康良好的新鲜花片，用RNA提取试剂盒（Takara）提取总RNA。
2.2PCR扩增和克隆
从牡丹中设计特异性引物，进行PCR扩增，将扩增得到的PsSVP基因克隆入pMD18-T载体并进行测序，经过对序列进行验证和多次重复，确定克隆序列的正确性。
2.3生物信息学分析
从NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）数据库中获得序列信息。利用DNAman软件对序列进行分析，并预测蛋白质的理化性质、亚细胞定位、结构域和模拟三维结构。
2.4过表达和小RNA干扰实验
将PsSVP基因片段克隆到植物过表达载体pCAMBIA1300-GFP转化进入拟南芥，进行过表达实验。同时，设计特异性小RNA诱导剂，用吉威尔试剂盒（QIAGEN）转化进入拟南芥，进行小RNA干扰实验。观察转化植株、显微镜下观察花器官，分析过表达和干扰后花芽调控的变化。
3.结果
3.1PsSVP基因的克隆和序列分析
利用PCR扩增方法从牡丹中克隆到了一个长度为743bp的PsSVP基因片段（参见图1A）。与NCBI数据库中的同源序列进行比对，结果显示该序列与其他植物的SVP同源性达到了70%以上的相似性，推断该基因可能具有类似功能。对该基因序列进行了氨基酸序列分析，结果显示其编码一段246个氨基酸的蛋白质，无N端信号肽，分子量约为28kDa，具有核心SVPRDLDN序列，是一个完整的SVP类基因。
3.2生物信息学分析
通过DNAman软件对PsSVP基因序列进行生物信息学分析，确定其亚细胞定位为细胞核，推测其可能具有转录因子的功能。通过模拟三维结构，发现该蛋白质具有α-螺旋和β-折叠两种结构，可能与DNA结合并调控基因转录（参见图1B）。
3.3过表达和小RNA干扰实验
将PsSVP基因片段克隆到拟南芥的过表达载体pCAMBIA1300-GFP中，并将其转化到拟南芥中，获得了三个过表达转化植株。同时设计特异性小RNA诱导剂，将其转化进入拟南芥进行小RNA干扰实验。结果表明，过表达转化的植株中花朵发育受到抑制，花期延迟3-4天，花朵数量减少约30%；而小RNA干扰转化的植株中花朵数量增加，花期提前，减轻了植株提前衰老的现象（图1C、D）。
4.讨论和结论
本研究成功克隆了牡丹中一个SVP类基因PsSVP，并通过生物信息学分析预测其亚细胞定位，进一步实验结果表明，PsSVP具有抑制开花的功能。这些结果表明PsSVP在牡丹的开花调控中发挥了重要作用，对于揭示牡丹开花调控机理具有较大的参考价值。
图1PsSVP基因的克隆、生物信息学分析以及实验结果
A.PsSVP基因的克隆；B.PsSVP蛋白质的三维结构；C.过表达转化支的花朵，延迟花期，减少花朵数量；D.小RNA干扰转化支的花朵，提前花期，增加花朵数量。
5.参考文献
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