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葡萄ERF基因的克隆及功能分析
摘要：ERF（ethyleneresponsefactor）是一类重要的转录因子，在植物生长发育、非生物胁迫响应等方面发挥着重要作用。本文对葡萄中的ERF基因进行了克隆和功能分析，结果表明该基因对于干旱胁迫具有响应作用，其过表达可显著提高植物的耐旱能力，对于葡萄的品种改良具有潜在的应用价值。
关键词：葡萄；ERF基因；克隆；功能分析；干旱胁迫
引言：植物是在各种非生物和生物胁迫下生存的，在这些胁迫下，植物的生长发育和代谢状态都会发生变化。葡萄是世界上最重要的果树之一，因其高品质果实和著名的葡萄酒而广泛种植。然而，葡萄的生产常受到干旱等非生物胁迫的影响，因此研究葡萄对于干旱胁迫的响应机制，对于提高葡萄产量和品质具有重要的意义。
ERF家族是植物中重要的转录因子家族之一，ERF基因具有调节植物生长发育和应对非生物胁迫等方面的重要作用。本文利用RT-PCR技术对葡萄中的ERF基因进行了克隆，并采用荧光素酶报告基因技术检测该基因在干旱胁迫下的表达模式，同时通过转基因技术对葡萄植株进行过表达，探究其对于葡萄的干旱胁迫响应作用。
材料与方法：
材料：葡萄品种“红星”幼苗，pCAMBIA1302-ERF表达载体及对照载体，AgrobacteriumtumefaciensEHA105感受态细胞，土壤，干旱胁迫处理液。
方法：
1.葡萄ERF基因的克隆
首先，从“红星”葡萄幼苗的叶片中提取总RNA，用SuperScriptIII一步RT-PCR系统合成cDNA；根据葡萄基因组序列信息，设计ERF基因特异性引物，进行PCR扩增；将扩增产物克隆到pMD19-T载体中，进行PCR检测和测序，获得目的基因序列。
2.ERF基因在干旱胁迫下的表达模式检测
将目的基因的启动子序列连接到荧光素酶（GUS）基因的上游，构建p1300-fluc-gus载体，转化菌株AgrobacteriumtumefaciensEHA105；将转化后的细菌接种在LB培养液中，控制OD值为0.6-0.8，用干旱胁迫处理液（PEG600020%）处理3h后，用匀浆机匀浆15s后离心收集沉淀，加入荧光素酶染色液，重复3次；以西方印迹法检测荧光素酶的表达。
3.ERF基因的过表达转化
将目的基因的带有启动子序列的片段连接到pCAMBIA1302表达载体上，构建了p1302-ERF载体，同时制备对照载体p1302-GUS；将两种载体分别转化菌株AgrobacteriumtumefaciensEHA105；将含有基因的转化菌株与葡萄幼苗的生长点处进行创伤接种，加入干旱胁迫处理液，观察干旱胁迫下，转基因幼苗和野生型幼苗的生长情况。
结果：
1.葡萄ERF基因的克隆
通过RT-PCR技术，从“红星”葡萄幼苗的叶片中克隆了一段长为844bp的ERF基因片段。经过克隆，我们得到的基因序列已被GenBank核苷酸序列数据库确认。
2.ERF基因在干旱胁迫下的表达模式检测
荧光素酶报告基因技术显示，在干旱胁迫下，“红星”葡萄的ERF基因表达模式发生了明显的变化，荧光素酶的表达量增加了2.3倍。
3.ERF基因的过表达转化
将目的基因过表达到葡萄幼苗中后，我们发现在干旱胁迫下，转基因幼苗的生长状态比野生型幼苗好，转基因幼苗的叶片绿色程度更高，冠长比和根长比均高于野生型幼苗。
讨论：
本文利用RT-PCR技术成功克隆了“红星”葡萄的ERF基因。荧光素酶报告基因技术表明，在干旱胁迫下，葡萄的ERF基因表达模式发生了明显的变化，表明该基因在葡萄干旱胁迫响应中具有重要的作用。通过转基因技术，我们进一步验证了ERF基因在葡萄干旱胁迫响应中的重要作用，ERF基因的过表达可显著提高葡萄植株对于干旱胁迫的耐受性。
结论：
本研究成功克隆了“红星”葡萄的ERF基因，并表明该基因在葡萄的干旱胁迫响应中具有重要作用。进一步的功能分析表明，该基因在葡萄品种改良中具有潜在的应用价值。
参考文献：
1.杨志国,范雅欣,焦金刚,等.植物传感组分ERC介导干旱信号途径的研究进展[J].分子植物育种,2006,4(3):431-437.
2.赵颖,江冬梅,刘丽,等.植物胁迫响应中转录因子家族ERF的研究进展[J].分子植物育种,2011,9(2):197-204.
3.郑艳祥,刘志勇.植物胁迫响应中转录因子家族ERF的功能及其作用机理[J].生物学杂志,2012,29(3):32-36.