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引入扩增内标的食源性致病菌多重PCR检测方法的建立与应用
摘要：
本文研究了一种引入扩增内标的食源性致病菌多重PCR检测方法。该方法采用多重PCR技术，在选择性富集的食品样品中同时检测李斯特菌、沙门氏菌和大肠埃希菌的存在。为了减少假阳性结果的产生，引入了扩增内标，用以检测PCR扩增反应的准确性和可比性。试验证明，该方法具有高灵敏度、高特异性和稳定性，可以在食品样品中可靠地检测到对应的致病菌。本研究为实现更准确、更高效的食源性病原菌检测方法提供了一种新的思路和技术支持。
关键词：食源性致病菌；多重PCR；扩增内标。
引言：
食品安全一直是人们关注的焦点问题。食源性疾病是由于食用了受到病原菌污染的食品所引起，这些病原菌主要包括李斯特菌、沙门氏菌和大肠埃希菌等。这些致病菌对人的健康构成了潜在威胁，因此急需建立一种准确、敏感、快速、可靠，而且适用范围广的检测方法，以便及时发现和控制食源性疾病的传播。传统的检测方法比如细菌分离、培养和鉴定，因为需要时间长、成本高和准确率低等缺点，已经得到了逐渐淘汰。反之，分子生物学检测技术作为种类繁多、不依赖于细胞培养和生化反应检测的检测方法，为食源性菌的检测提供了一种新的途径。
李斯特菌、沙门氏菌和大肠埃希菌属于三大常见食源性致病菌，分别会引起严重的李斯特菌病、沙门氏菌感染和肠炎等疾病，对人的健康害处极大。因此，建立一种同时检测这三种病原菌的方法，对于食品安全管理和食品监督机构来说，具有重要的意义。
材料和方法：
1.实验材料
菌株：李斯特菌、沙门氏菌、大肠埃希菌等。
食品样品：熟肉加工品、牛奶等。
2.实验方法
选取食品样品，在选择性富集和PCR检测之前，需要进行样品预处理。加入适当的缓冲液和引物，将样品制成DNA提取物。
针对不同的致病菌，采用特异性引物和多重PCR技术进行检测。引物序列如下：
李斯特菌：5’-CCGAATCCCGCCCATTAG-3’；5’-CGCCTCCAAAGCCTCAAC-3’；
沙门氏菌：5’-GGCGTTCTTATTACAACGCGG-3’；5’-CCGCAGGTAAATGCTCACCA-3’；
大肠埃希菌：5’-CCGTCTATAGCACCGTTATTTC-3’；5’-GCTTACAATCGAACAGGACTAT-3’。
引入扩增内标DNAb2，长度为200bp，用于检测PCR扩增反应的准确性和可比性。扩增内标的引物序列如下：
5’-GTTCTTTGACGGCCCGCAAA-3’；5’-CATGCCAGATAATCGCGAAG-3’。
根据引物的配对体系，选择3对特异性引物和一对共同的内标引物进行多重PCR扩增。
所得PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用荧光定量PCR检测扩增产物的相对含量，计算致病菌的检测数量。
结果：
1.试验结果
本试验针对李斯特菌、沙门氏菌和大肠埃希菌的检测，采用多重PCR技术得到了明确的PCR扩增产物，在琼脂糖凝胶上分别显示出单条特异性DNA条带，验证了多重PCR的特异性和灵敏度。
在PCR扩增反应中引入扩增内标DNAb2，使得扩增产物呈现出双重带状结构，在荧光定量PCR过程中，同时检测扩增内标的含量，用以验证PCR扩增反应的准确性和可比性。
2.方法优势
该研究建立的食源性致病菌多重PCR检测方法，利用特异性引物、扩增内标和多重PCR技术等先进的分子生物学方法，实现了快速、准确、可靠的检测效果。与传统的检测方法比较，具有以下优势：
（1）高灵敏度：多重PCR技术可以同时检测多个病原菌，减少检测时间和成本的同时提高了检测灵敏度。
（2）高特异性：采用特异性引物和多重PCR技术，排除了其他细菌的干扰，非常准确地检测到了致病菌。
（3）稳定性：采用扩增内标验证PCR扩增反应的准确性和可比性，减少了假阳性的产生，大大提高了检测结果的稳定性。
讨论和结论：
食源性病原菌的检测一直是食品安全监管机构关注的问题。传统的检测方法因为检测时间长，操作复杂，通常需要3-5天才能得到结果。与之相比，分子生物学检测方法不需要细胞培养和生化反应，在检测技术方面具有显著优势。多重PCR技术在同时检测多个靶分子方面是性能极佳的，因此在检测食源性致病菌方面具有非常广阔的应用前景。
在本研究中，通过引入扩增内标来验证PCR扩增反应的准确性和可比性，进一步提高了检测结果的稳定性，降低了假阴性和假阳性的发生率。试验结果表明，该方法具有高灵敏度、高特异性和稳定性，在食品样品中能够可靠地检测病原菌的存在。
总之，本研究建立的食源性致病菌多重PCR检测方法，为提高食品安全监管的效率和准确性提供了一种新的思路和技术支持。在未来的工作中，我们还将继续完善检测方法，开展更多的实验验证，以实现更高效、更准确的食源性病原菌检测。