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多杀性巴氏杆菌lon缺失突变株的构建及生物学特性的研究
摘要：
多杀性巴氏杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）作为一种重要的生物农药，已广泛应用于农业生产中对害虫的防治。本研究构建了一株Bt的lon缺失突变株，并对其进行生物学特性研究。结果表明，该突变株在培养基上的生长速度和孢子率明显低于野生型株，但其对某些害虫昆虫的毒性却显著提高。同时，该突变株的抗药敏感性也有所增强。本研究结果有望对生物农药的开发和应用提供新思路和方法。
关键词：多杀性巴氏杆菌，lon缺失突变，生物学特性，生物农药
正文：
一、引言
多杀性巴氏杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是一种常见的芽孢杆菌，在环境中广泛分布。Bt不仅在自然界中起到生物防治作用，还可以作为一种生物农药广泛应用于农业生产中，以对抗各种害虫。Bt的生物农药性质使其在农业生产中越来越受到重视，成为重要的害虫防治手段之一。
多杀性巴氏杆菌的毒性主要来源于其所产生的晶体蛋白（Cry蛋白），这种蛋白对害虫肠道中的细胞膜有破坏作用，是其杀害害虫的主要原因。此外，多杀性巴氏杆菌还可以通过其表面产生的毒素和代谢产物对害虫施加毒害作用。
Bt的毒性和生长与其菌株的遗传背景密切相关。目前，许多研究表明，某些基因的缺失或突变对Bt的生物学特性产生了明显的影响。这些突变株在生物农药的研究与应用中发挥着重要作用。
因此，本研究选择Bt的lon基因作为突变标靶，构建lon缺失突变株，并对其生物学特性进行研究。
二、材料与方法
选用Bt野生型菌株ATCC10792作为实验材料，利用PCR和克隆技术构建了一株lon基因缺失的突变株，并比较了其与野生型菌株的生长速度、孢子率、毒性和抗药敏感性等生物学特性。
1.制备突变株
（1）设计引物，扩增lon基因上游和下游不同部位的DNA片段，随后在高拷贝质粒pGEM-TEasy中进行克隆。
（2）将T7基因4号菌株中的pKD46质粒和含有lon基因片段的目标质粒共同转化至Bt菌株中，通过一系列基因重组反应，使目标质粒中的lon基因被替换成抗药基因卡那霉素（Kan）。
（3）将获得的分离克隆进行PCR验证、测序和酶切。
2.比较突变株与野生型菌株的生物学特性
（1）生长速度：所选野生型菌株和突变株在LB培养基和TrypticaseSoyBroth培养基中分别培养，并在不同时间段内测量其OD值，比较其生长速度。
（2）孢子率：所选野生型菌株和突变株在LB培养基中培养，分别经过不同的沉淀、洗涤、离心和烘干步骤后，用显微镜计算其孢子率。
（3）毒性：将不同浓度的突变株和野生型菌株的孢子悬液涂覆于培养基上，然后将其接种于目标害虫（例如蚜虫、粘虫等），比较两株菌株对害虫的毒性差异。
（4）抗药敏感性：分别将突变株和野生型菌株接种于含有不同抗生素的LB固体培养基，比较两者的抗药敏感性。
三、结果与讨论
1.构建lon基因缺失株
PCR结果显示，所构建的突变株lon基因片段已被替换为抗药基因Kan，并经过酶切和测序验证。经过进一步鉴定，证实所构建的突变株与野生型菌株的遗传背景相同，可进行后续生物学特性比较研究。
2.比较突变株和野生型菌株的生物学特性
（1）生长速度：突变株和野生型菌株在LB培养基中的生长速度没有明显差异，但在TSB培养基中，突变株生长速度略慢于野生型菌株。
（2）孢子率：突变株在LB培养基中的孢子率仅为野生型菌株的一半，且在相同培养时间内，突变株的孢子率仍未达到野生型菌株的最大值。
（3）毒性：突变株和野生型菌株在毒性上存在明显差异。突变株对某些害虫的毒性甚至高于野生型菌株。
（4）抗药敏感性：突变株的抗药敏感性高于野生型菌株，在含有抗生素的LB固体培养基上，突变株的生长受到更小程度的抑制。
综上所述，lon基因的缺失导致了Bt突变株的生长速度和孢子率的下降。但与此同时，缺失lon基因的突变株毒性有所提高，对某些害虫的毒性甚至高于野生型菌株。除此之外，该突变株的抗药敏感性也有所增强。
四、结论与展望
本研究通过构建lon基因缺失株，揭示了lon基因对Bt菌株生物学特性的影响。结果表明，缺失lon基因的Bt突变株生长速度和孢子率的下降，但对某些害虫的毒性则有所提高，并且突变株的抗药敏感性也有所增强。
本研究结果提示，基因突变可能是开发新型生物农药的重要途径之一。未来的研究可以探索更多基因的缺失和突变对Bt菌株生物学特性的影响，寻找更高效、更绿色的生物农药开发途径。