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姜黄素诱导人髓母细胞瘤Daoy细胞自噬及其机制研究
摘要
人髓母细胞瘤是一种常见的儿童恶性肿瘤，自噬作为一种细胞自我调节的生存机制，近年来被证实参与了肿瘤的生长、转移等方面。本文主要研究姜黄素对人髓母细胞瘤Daoy细胞自噬的影响及其机制。实验结果表明，姜黄素可以显著诱导Daoy细胞自噬，抑制其生长和增殖。进一步研究发现，姜黄素通过激活AMPK/mTOR通路以及调控Bcl-2家族蛋白的表达实现对Daoy细胞自噬的调控。本文结果有望为人髓母细胞瘤的治疗提供新的思路和途径。
关键词：人髓母细胞瘤；自噬；姜黄素；AMPK/mTOR通路；Bcl-2家族
Abstract
Medulloblastomaisacommonmalignanttumorinchildren,andautophagy,asaself-regulatingsurvivalmechanismofcells,hasbeenshowntobeinvolvedinthegrowth,metastasisandotheraspectsoftumorsinrecentyears.ThispapermainlystudiestheeffectofcurcuminontheautophagyofDaoycellsofmedulloblastomaanditsmechanism.TheexperimentalresultsshowedthatcurcumincansignificantlyinduceautophagyofDaoycells,inhibittheirgrowthandproliferation.FurtherstudieshavefoundthatcurcuminregulatestheautophagyofDaoycellsbyactivatingtheAMPK/mTORpathwayandregulatingtheexpressionofBcl-2familyproteins.Theresultsofthisstudyareexpectedtoprovidenewideasandapproachesforthetreatmentofmedulloblastoma.
Keywords:medulloblastoma;autophagy;curcumin;AMPK/mTORpathway;Bcl-2family
1.引言
人髓母细胞瘤是一种常见的儿童恶性肿瘤，发病率在各种儿童恶性肿瘤中排名第二[1]。尽管现在外科手术、化疗、放疗等多种治疗手段相继出现，但由于肿瘤的高度异质性、易于侵袭转移以及化疗副作用等问题，使得该病的治疗仍是一个严峻的挑战。
自噬作为一种通过自我分解并回收组织细胞成分的生化过程，在细胞内的稳态调节、细胞凋亡、免疫应答等方面具有重要生理功能[2]。自噬在肿瘤的发生、发展、治疗等方面也已越来越受到关注[3]。近年来，越来越多的研究表明，调节肿瘤细胞的自噬过程，对治疗肿瘤具有潜在的治疗价值。
姜黄素，又称为土田酮，是从姜黄根中提取出的一种黄色染料，常被用于烹调食品中。研究表明，姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[4]，其中其通过调节肿瘤细胞的自噬过程来实现对肿瘤的治疗效果，已经成为一个热门的研究方向[5-7]。
本文主要从自噬的角度出发，研究姜黄素对人髓母细胞瘤Daoy细胞的自噬过程的影响及其机制。
2.材料与方法
2.1细胞培养
Daoy细胞系由中国科学院细胞生物学研究所提供。细胞在DMEM培养基中加入10%FBS、1%青霉素链霉素，37℃、5%CO2培养，每2-3天更换一次培养基。
2.2滴度测定
Daoy细胞在96孔板中处理3天后，加入10μLCCK-8液体，37℃，继续培养0.5h。液体吸光度测定器（ELX-II）测量细胞总数波长下的吸光度，如图1所示。
2.3显微镜观察
Daoy细胞在6孔板中处理后，用PBS清洗2次后加入AO（5μg/mL）和EB（5μg/mL）染色，细胞治疗后进行荧光显微镜观察。
2.4Westernblotting
用RIPAlysis缓冲液从Daoy细胞中提取总蛋白质，将其分离于10%SDS-PAGE凝胶，并转移到PVDF膜上。随后，用5%不含脂牛奶的TBST溶液封闭膜并孵育2小时。用TBST溶液含有特异性抗体（LC3、Beclin1、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR）短暂孵育过夜，并用特异性HPR荧光标记了目标分子。结果通过ECL显像仪显示图像和分析数据。
2.5基因沉默
使用siRNA基因沉默技术去除Daoy细胞中LC3II蛋白的表达。siRNA（50nM）在Lipofectamine2000中稀释并转染到细胞中，24小时后处理姜黄素。
3.结果
3.1姜黄素抑制Daoy细胞的生长
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