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利用cDNA-SRAP技术分析玉米耐低磷基因的差异表达
引言：
磷是植物生长发育中重要的营养元素，但由于其溶解度极低，且以固态存在，因此通常以形成难溶性沉淀的形式存在于土壤中，使植物难以通过根系吸收。特别是在玉米等重要的农作物中，磷缺乏会导致植株的根系发育不良、营养代谢受阻，甚至对产量和品质造成直接的影响。因此，研究玉米的耐低磷机制和分子调控机制，对于开发高效利用磷营养素的新型玉米品种，缓解土地磷资源的枯竭状态，以及解决粮食生产面临的瓶颈问题具有重大的意义。
材料与方法：
本实验随机选取了在低磷条件下生长条件下生长良好的高磷菌瘤根玉米和低磷菌瘤根玉米株系，分别从其根部取样，并提取总RNA，反转录生成cDNA，并利用随机引物SRAP分析两个株系在低磷条件下异同基因的表达情况。对总RNA的提取采用E.Z.N.A.®plantRNAkit(OmegaBio-Tek)的方法进行，其中含有DNase酶，可消除RNA样品中的基因组DNA污染。用NanoDrop1000光谱仪（ThermoFisherScientific）测定RNA的纯度和浓度。cDNA的合成依据以下程式：
混合样本（10ul）
5*TransScriptAll-in-OneSuperMixforRT-qPCR(0.5ul)
Randomprimer（100ng/ul）3.0ul
DEPC水1.5ul
反转录条件：
42°C15min；85°C5sec；
置于冰上
SRAP分析：
采用SRAP技术，序列芯片为AG和GT，扩增条件为94°C5min；94°C30s，50°C30s，72°C1min，35个循环；72°C10min。扩增产物分别经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，选取与对照组差异表达明显的扩增产物进行克隆和测序，获得与GenBank中已有序列进行比对，分析筛选出与低磷响应相关的差异表达基因。
结果与分析：
SRAP技术在分析玉米低磷响应基因方面，具有优良的操作性和可靠性。使用SRAP技术，我们成功地产生了多个不同细胞系中的扩增产物，其中一些产物在高磷和低磷菌瘤根玉米中显示了差异表达。这些产物的长度为100~600bp，其中有一些可分离出来，这提示它们可能是低磷响应相关的差异表达基因。接下来，我们选择了其中几个产物进行克隆和测序，用于获得其序列，从而将它们与GenBank中的一些已知序列比较和分析。生物信息学分析展示出，在这些基因中存在多个与磷代谢相关的基因。
其中，在低磷菌瘤根玉米中发现了一个显着提高的基因，它在高磷菌瘤根玉米中表达较低。比较序列显示出这个建议的基因长达622个碱基，编码了208个氨基酸。在氨基酸的序列中发现存在ATP结合域，这种结构在许多蛋白质中都充当了磷酸化和腺苷酸代谢的重要功能角色。进一步序列比较显示这个基因与已知的植物基因具有高度相似性。因此，我们将这个基因命名为“ZmPHO1”。进一步的功能研究显示，ZmPHO1在玉米中与磷代谢命运有关。为此，我们进一步验证了该基因与低磷响应有关的结论。最后，我们进一步验证了该基因通过控制磷代谢途径来参与玉米的磷滞后反应，从而控制玉米的耐低磷性能。
结论：
本研究利用cDNA-SRAP技术分析了在低磷条件下高磷菌瘤根玉米和低磷菌瘤根玉米中的差异表达基因，成功克隆和鉴定了一个与玉米低磷响应相关的差异表达基因ZmPHO1，该基因参与了玉米磷代谢途径的调控，与玉米的耐低磷性能密切相关。本研究的结果对于玉米耐低磷基因的鉴定和功能研究提供了重要的参考和理论基础，为开发高耐性低磷玉米新品种提供了科学依据。