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DNMT1基因shRNA慢病毒稳定转染KYSE150细胞株的建立及鉴定
DNMT1基因shRNA慢病毒稳定转染KYSE150细胞株的建立及鉴定
摘要：DNA甲基转移酶1（DNMT1）是DNA甲基化的关键酶，其在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用。本实验旨在通过稳定转染shRNA来沉默KYSE150细胞株中的DNMT1基因，并建立shRNA转染成功的实验组和对照组。结果表明，稳定转染后DNMT1基因的表达水平明显下降，且转染组细胞的增殖能力和侵袭能力均明显降低，说明本实验成功建立了稳定转染DNMT1shRNA的KYSE150细胞株。
关键词：DNMT1基因；shRNA慢病毒；转染；细胞株
一、引言
DNMT1是DNA甲基转移酶家族成员之一，在维护基因组DNA甲基化修饰状态中发挥着极其重要的作用。已有研究表明，DNMT1在肿瘤细胞中的表达水平往往明显升高，导致肿瘤的生长和转移。因此，通过靶向沉默DNMT1基因，有望从分子水平上探究其在肿瘤发生和发展过程中的作用机制。
RNA干扰技术已经成为靶向沉默特定基因的一种重要手段。其中，利用慢病毒稳定转染shRNA技术能够有效沉默目的基因，从而实现探究基因功能和相关疾病的机制。因此，本实验利用shRNA慢病毒技术，旨在成功建立稳定转染DNMT1shRNA的KYSE150细胞株，并对其进行鉴定与评价。
二、材料与方法
2.1实验材料
KYSE150细胞株、shRNA载体pLKO.1、慢病毒包装质粒、293T细胞、Opti-MEM培养基、DMEM培养基、FBS、脱氧胆酸、Matrigel。
2.2实验方法
2.2.1DNMT1shRNA的设计与构建
利用RNAi设计算法设计出4个针对DNMT1的shRNA，筛选出最佳的shRNA序列，插入到pLKO.1载体中，构建出含有DMNT1shRNA的慢病毒载体。
2.2.2慢病毒包装及稳定转染
将含有DNMT1shRNA和包装元件的慢病毒质粒转染到293T细胞中，等待包装完成。采用脱氧胆酸盐/PEG共沉淀法收集慢病毒上清液，加入Matrigel后稳定转染KYSE150细胞株。
2.2.3稳定转染细胞的筛选及鉴定
通过荧光定量PCR和Westernblotting等方法筛选出含有DNMT1shRNA的KYSE150细胞株。使用CCK-8、Transwell和WoundHealing等细胞功能实验，对转染组和对照组细胞的生长、增殖、迁移和侵袭等性质进行分析。
三、结果
3.1DNMT1shRNA的构建
本研究设计了4个针对DNMT1的shRNA序列，通过荧光定量PCR检测，发现shRNA构建成功，并成功插入pLKO.1载体中（图1）。
3.2KYSE150细胞株的慢病毒转染
将包含DNMT1shRNA和包装元件的慢病毒质粒转染到293T细胞中，并采用脱氧胆酸盐/PEG共沉淀法收集慢病毒上清液，加入Matrigel后转染KYSE150细胞株。稳定转染后，转染组和对照组细胞均呈现正常生长和形态（图2）。
3.3转染细胞的筛选及鉴定
通过荧光定量PCR和Westernblotting等方法筛选出含有DNMT1shRNA的KYSE150细胞株，发现转染组DNMT1基因的表达水平已经明显下降（图3）。同时，转染组细胞的增殖能力和侵袭能力均明显降低，说明DNMT1shRNA的转染成功沉默了DNMT1基因（图4）。
四、讨论
DNMT1是DNA甲基转移酶家族成员之一，在肿瘤细胞中起着重要的作用。由于其对DNA甲基化修饰状态的维护和调控，在肿瘤生长和转移过程中始终存在着较高的表达水平。因此，针对DNMT1基因进行RNA干扰，是一种有望治疗肿瘤的手段。在此实验中，我们设计了4个针对DNMT1的shRNA序列，并通过荧光定量PCR检测，发现其中一组shRNA序列的构建成功。
慢病毒稳定转染技术已经成为靶向沉默目的基因的一种常用方法。在本研究中，我们将包含DNMT1shRNA和包装元件的慢病毒质粒，转染到293T细胞中包装成病毒，再加入Matrigel转染到KYSE150细胞株中。通过荧光定量PCR和Westernblotting等方法筛选出含有DNMT1shRNA的KYSE150细胞株，发现DNMT1基因的表达水平明显下降。
此外，在转染组细胞的功能实验中，我们发现转染组细胞的生长、增殖、侵袭等能力均明显降低，说明DNMT1shRNA的稳定转染成功沉默了DNMT1基因，在一定程度上抑制了细胞的生长和转移。
综上所述，本实验成功建立了含有DNMT1shRNA的慢病毒稳定转染KYSE150细胞株，实现对DNMT1基因的沉默，并初步评估了其对肿瘤细胞生长和转移的影响。该研究结果为进一步探究DNMT1基因在肿瘤生长和转移中的作用机制提供了实验基础。
参考文献
1.Li,X.,&K