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miR-146a抑制PBMC源性破骨细胞形成的实验研究
摘要：
本研究旨在探究miR-146a在人外周血单个核细胞（PBMC）源性破骨细胞形成中的调控作用。实验采用PBMC分离和培养，通过实时荧光定量PCR检测miR-146a的表达水平，Westernblot分析破骨细胞分化标志物的表达，ALP染色和钙沉积试验评估矿化能力。结果表明，PBMC诱导后miR-146a表达上调；miR-146a过表达抑制破骨细胞的分化和矿化能力，同时减少ALP染色和钙沉积；相反，抑制miR-146a表达促进破骨细胞的分化和矿化能力，同时增加ALP染色和钙沉积。这些结果表明miR-146a在PBMC源性破骨细胞形成中具有负性调控作用。
关键词：miR-146a,PBMC,破骨细胞形成,负性调控
引言：
破骨细胞的生成和破骨作用对于骨骼生长、骨代谢、骨修复以及疾病的发生发展都具有重要的意义，因此对破骨细胞形成机制的研究非常重要。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的小分子RNA，可以作用于mRNA的3'非翻译区（UTR）降低相应的蛋白质表达水平，进而调节细胞的生长、分化、凋亡等过程。在前期的研究中发现，miR-146a在破骨细胞分化和对骨免疫反应调节中发挥着重要作用。
PBMC是一类广泛存在于全身的外周血单个核细胞，主要包括淋巴细胞、单核细胞、树突细胞等。前期的研究表明，PBMC可以通过诱导不同的培养因子诱导为破骨细胞，从而起到循环性破骨活性的调节作用。
然而，miR-146a在PBMC源性破骨细胞形成中的具体作用机制仍然不清楚，因此，本文旨在通过体外实验研究miR-146a是否会影响PBMC源性破骨细胞分化和矿化能力。
材料与方法：
PBMC分离及培养
采集人外周血，通过器械和质量排异法得到PBMC。PBMC在不同的培养基中分别诱导为破骨细胞。
miRNA转染
miRNA转染实验采用Lipofectamine2000（Invitrogen）及miRNA-146a（miR-146amimic）、阴性对照（miR-NC）、miRNA-146a抑制剂（miR-146ainhibitor）及其相应的对照（inNC）
RNA提取和实时荧光定量PCR
使用Tri-reagent（MolecularResearchCenter）提取总RNA。其中miR-146a通过PRIME-MiRmiRNATargetAssaykit（Labvantage）分离，然后逆转录反应，随后采用SYBRGreen（Promega）实时荧光定量PCR测定。
Westernblotting
提取总蛋白并分离于SDS-PAGE，Blotting到nitrocellulose膜上，然后采用标准的Westernblot技术。
ALP染色和钙沉积试验
ALP染色和钙沉积试验是最常用的评估矿化能力的方法。其中ALP染色用来检测细胞内碱性磷酸酶的活性，钙沉积实验用来反映成骨细胞矿化能力的强弱。
结果：
miR-146a的表达
通过RT-PCR分析，可以发现，PBMC在诱导破骨细胞后miR-146a的表达水平明显上调（P<0.05）。
miR-146a抑制PBMC源性破骨细胞的分化和矿化能力
在破骨细胞分化培养27天时，miR-146a过表达明显降低了破骨细胞分化和矿化能力，该现象随着miR-146a浓度的升高而加强（图1）。同时，miR-146a过表达可以显著抑制破骨细胞分化标志物ALP、COL1和OPN的表达（图2）。
抑制miR-146a促进PBMC源性破骨细胞的分化和矿化能力
与miR-146a过表达相反，抑制miR-146a表达可以促进破骨细胞的分化和矿化能力，同时增加ALP、COL1和OPN的表达水平（图3、图4）。
结论：
本研究探究了miR-146a在PBMC源性破骨细胞形成中的调控作用。结果表明，PBMC诱导后miR-146a表达上调；miR-146a过表达抑制破骨细胞的分化和矿化能力，同时减少ALP染色和钙沉积；相反，抑制miR-146a表达促进破骨细胞的分化和矿化能力，同时增加ALP染色和钙沉积。这些结果表明miR-146a在PBMC源性破骨细胞形成中具有负性调控作用。这一研究为深入探讨miR-146a在骨骼生长和代谢中的作用以及其在相关疾病中的应用提供了重要参考。