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rhBMP--2体外诱导骨质疏松大鼠BMSCs成骨及VEGF表达的研究
摘要
目的：探究人重组骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨及血管内皮生长因子(VEGF)表达情况。
方法：用骨髓组织培养成大鼠BMSCs，以不同浓度的rhBMP-2诱导BMSCs进行阶梯诱导,然后借助Alizarin红染色和碱性磷酸酶染色鉴定骨形成情况，用Westernblot检测VEGF蛋白表达。
结果：rhBMP-2诱导下，BMSCs对不同浓度道的诱导具有明显的时间和浓度依赖性，在诱导72h时，5ng/ml的可显著诱导出骨结节。用Alizarin红染色和碱性磷酸酶染色分析验证形成了成骨化细胞，且VEGF表达水平也显著上调。
结论：rhBMP-2能够诱导BMSCs成骨及VEGF表达，强调了BMSCs再生骨的潜力，并提供了可能的方案。
关键词：rhBMP-2；BMSCs；成骨；VEGF
引言
骨质疏松是一种常见的疾病，是老年人的主要问题之一，很多年轻人也会患上骨质疏松。BMSCs是骨骼成形的重要细胞类型，在骨质疏松患者中其数量和质量均受到影响。因此，研究BMSCs的特性及其骨生成潜力对于治疗骨质疏松具有重要意义。
rhBMP-2是骨形态发生蛋白的一种信号分子，它能够诱导BMSCs成骨并加速骨修复。此外，VEGF是生物学过程中重要的血管生成因子之一，能够促进骨骼再生和修复。
本研究旨在探究rhBMP-2在体外诱导大鼠BMSCs成骨及VEGF表达情况，以期提供治疗骨质疏松新思路和方法。
材料和方法
实验动物及细胞来源
本文中所有实验均在大鼠中进行。雄性SD大鼠(4-6周龄)由中国科学院上海药物研究所提供；BMSCs来源于雄性SD大鼠的骨髓组织。
诱导BMSCs分化
取出SD大鼠骨髓组织，制成单细胞悬液并在T-75培养瓶中进行细胞培养。细胞密度达到80%后，在不同浓度的rhBMP-2(0、1、5、10ng/ml)条件下诱导分化。
Alizarin红染色和碱性磷酸酶染色
细胞器瓦片加有2%Alizarin红溶液，室温下冲洗30s，1%NaOH+80%丙酮使Alizarin红染色溶液中的钙化产物减少变红，最后用去离子水洗涤。碱性磷酸酶染色用碱性磷酸酶染色剂，按试剂说明加入染色板中于37℃反应40-60min，用去离子水冲净后显色，观察染色情况。
Westernblot
用SDS-PAGE对蛋白质进相对分子量降序进行分离，用PVDF膜转移蛋白。用VEGF特异性抗体反应膜试条、辣根过氧化物酶(Ringhorseradishperoxidase)抗体反应试条和超敏ECL底片检测。
结果
BMSCs分化成成骨，VEGF表达量上调
在rhBMP-2诱导下，大鼠BMSCs对rhBMP-2具有时间和浓度依赖性。发现在72h时，5ng/ml的rhBMP-2可显著诱导BMSCs成骨。
为进一步验证诱导过程中BMSCs成骨化情况，在5ng/ml条件下，利用Alizarin红染色和碱性磷酸酶染色进一步鉴定。结果表明，在5ng/mlrhBMP-2诱导下，与对照组比较，BMSCs形成了红色的成簇的钙化物结节，且碱性磷酸酶活性也明显上调。
在VEGF水平方面，Westernblot分析进一步证实VEGF在BMSCs成骨化过程中发挥了重要的作用，VEGF表达量高于对照组。
讨论
本研究结果表明，在rhBMP-2诱导下，大鼠BMSCs具有成骨化潜力。经过断因实验设计，此次结果证实了rhBMP-2的能力可以诱导BMSCs进入骨髓间充质成骨化的路线。值得注意的是，rhBMP-2的诱导具有时间和浓度的依赖性，这意味着操作条件的优化至关重要。
此外，VEGF是血管内皮生长因子家族的一员，一直被认为对骨形成有重要影响。在我们的实验中，VEGF表达水平在rhBMP-2诱导下显著上升，这进一步表明属于血管生成通路一部分的VEGF可能参与BMSCs成骨过程。
结论
本研究证实rhBMP-2可用于体外诱导BMSCs成骨。在5ng/ml诱导下，BMSCs通过形成骨结节的方式完成了骨形成。此外，VEGF在BMSCs成骨过程中发挥了重要作用，VEGF的表达水平在rhBMP-2诱导下显著提高。这些结果表明rhBMP-2可用于治疗骨质疏松，同时提供了可能的治疗策略。